本发明专利技术属于分子生物学和药理学技术领域，包括用知母水提物给小鼠灌胃的方法，发现能够通过特异性抑制解偶联蛋白２（ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ２，ＵＣＰ２）的表达，从而治疗胰岛素抵抗。本发明专利技术将知母经过水煎煮，用旋转蒸发仪浓缩以及减压冻干，得到晶体状浓缩提取物。用该提取物配置成一定浓度的水溶液给小鼠灌胃，发现能够显著的抑制小鼠肾脏中ＵＣＰ２的表达。本发明专利技术阐明了知母水提物能够特异抑制ＵＣＰ２蛋白在肾脏中的表达，可开发为改善和治疗胰岛素抵抗的药物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学和药理学
二、 技术背景胰岛素抵抗是指靶细胞对胰岛素的敏感性下降，需要更多的胰岛素才能维护 正常的血糖浓度，表现为外周组织尤其是肌肉、脂肪组织对葡萄糖的利用障碍。发病早期胰腺e细胞可以代尝性地增加胰岛素的分泌量以弥补其效应不足，但随 着胰岛e细胞功能的逐步衰竭，即代偿机制的丧失，就会表现出胰岛素抵抗，高 胰岛素症，高血糖等继而引发糖尿病。现代医学表明，胰岛素抵抗是众多心血管 疾病及糖尿病的共同危险因素，会引起多种代谢相关疾病。UCP2是胰岛素分泌的负调节分子。它介导了线粒体内膜的质子渗漏，这已被一系列的研究所证明，这些研究的对象涵盖了原脂质体、线粒体以及完整细胞(Krauss S, et al. Proc. Natl. Acad. Sci， U.S.A. 99:118-122， 2002)。在胰岛p细胞中， UCP2介导的质子渗漏使得糖生成的ATP数量降低，从而负调节胰岛素分泌。小鼠是肥胖导致的糖尿病动物模型，在该小鼠胰岛中，UCP2表达显著升 高。另外，高血糖也能导致胰岛内UCP2表达升高。更重要的是，在o6/o6小鼠 中敲除UCP2，胰岛素分泌的第一相能得到恢复，并且血清中胰岛素含量升高， 高血糖症状也得到改善(Zhang CY， et.al. Cell 105: 745-755， 2001 )。这些结果充分 说明，UCP2在高血糖以及肥胖导致的胰岛功能异常中发挥了重要作用。因此， 设法抑制UCP2在的表达在制备改善胰岛素抵抗的药物中具有广阔的前景。知母为百合科植物知母e/warr/2e朋氾/^ofife/o!Vfey)的干燥根茎，具有滋 阴降火，润燥滑肠的功效，临床为多味治疗消渴症方剂的君药；中医讲究阴阳 调和，认为疾病是由于寒热失调所引起的，然而这些理论过于虚幻，缺少现代 分子生物学研究支持。因此，我们以知母提取物为研究对象，充分运用分子生物 学的实验手段证实了知母可以通过抑制UCP2的表达从而改善胰岛素抵抗的目 的，为改善并治疗胰岛素抵抗提供了新的效果显著的药物。三、
技术实现思路
本专利技术的需要解决的问题是利用知母提取物抑制UCP2蛋白的表达并将知 母提取物开发成改善胰岛素抵抗的药物。1. 本专利技术所述知母提取物的制备，知母的主要成分是皂苷、黄酮、双苯吡酮、 木质素等。2. 知母水提物通过特异性抑制UCP2蛋白的表达，从而达到治疗胰岛素抵抗的 实验方法知母水提物给小鼠灌胃2次，间隔8h，用量为90mg/kg;发现在第2 次灌胃后6小时后处死小鼠，UCP2的信使核糖核酸在肾脏中的表达量下降了约 30%。3. 知母水提取物可以开发成一种改善胰岛素抵抗的药物。 本专利技术首次阐明了知母水提取物具有特异性抑制UCP2的效应。目前中医和现代分子生物学的研究还没有很好的结合起来，中药作用的特异性靶位点更是知 之甚少。本研究室首次提出UCP2是胰岛素分泌的负调控因子(Zhang CY, et.al. Cell 105:745-755, 2001)，在肥胖导致的胰岛功能异常中扮演了重要角色。在此 基础上，又进一步发现知母的提取物作用的靶位点就是UCP2，通过特异性抑制 UCP2的表达来提高胰岛素分泌，从而达到改善胰岛素抵抗的目的。对胰岛素抵抗的治疗目前临床上多以西药为主，不仅有副作用，用久了还会 产生治疗失效；中药作为我国的传统治疗药物，从临床和实验研究的角度， 均证实其药性温和持久且副作用小(W.L丄i,etal.JEthnopharmaco1，92 : 1,2004)， 因而知母开发作为改善胰岛素抵抗的药物具有巨大的展前景。四附图说明图1为给药2次后用普通PCR( RT- PCR)定性检测小鼠肾脏中UCP2信使核 糖核酸的表达情况(从左向右1一5为对照组，6—IO为给药组)；图2为给药2次后用定量PCR( Real-time PCR)检测分析小鼠肾脏中UCP2 信使核糖核酸表达的变化的结果图。五具体实施方式材料与来源试剂，Trizol购自Invi加gen公司；逆转录酶和Tag酶购于大连宝生物工程有限公司。手术器械剪刀，弯头小镊等购自江苏思来科技有限公司。 其它器材Heidolph DIAX900匀浆器；ABI Prism 7000 Sequence Detection System PCR仪；C57BL/6小鼠购于南京大学模式动物中心 实施例1. 知母提取物的浓缩方法150g知母加入lL的蒸馏水，加热至沸腾后，煎 煮2h，留取上清，残渣重复上述过程一次。两次上清转至旋转蒸发仪60'C蒸发 约4h后，低温冻千；于4X:保存。2. 小鼠给药及组织的分离保存实验用小鼠为SPF级的野生型雄性小鼠， 品系C57BL/6， 8周龄，饲养于南京市鼓楼医院动物实验中心。用灌胃针按 90mg^g药量灌胃给药2次，时间间隔8h;对照组小鼠用等体积的生理盐水灌胃。 第2次灌胃后6h处死小鼠；取小鼠肾脏组织，生理盐水漂洗干净，立即放于冻 存管中，于液氮中保存备用。3. 组织RNA的提取、RT-PCR和real-time PCR取适量组织加lml Trizol 量于Heidolph DIAX900组织匀浆器将组织充分匀浆(3档90秒)，将匀浆液转 入洁净的1.5ml离心管中，加入200ul氯仿，13200rpm离心10分钟，小心吸 取上清至另一洁净的1.5ml离心管中，加入等体积的异丙醇，13200rpm离心10 分钟，弃上清，75%乙醇洗漆沉淀，室温干燥，20nl DEPC水溶解，紫外分光 法检测浓度和纯度。2wgRM用于逆转录，反应体系为20ul，含2PgRNA， lmM dNTP, RNA酶抑制剂1 U/u 1, 01igo(dT)18引物2.5pmol/w 1, AMV逆转录酶0. 5 U/ul,轻轻混匀，42'C 1小时，冰上放置2分钟，所得cDNA可用于real-time PCR。 real-time PCR为20 y 1反应体系，分别含0. 5 y 1 (检测GAPDH)和1. 5 y 1(检测UCP2) cDNA, 2 mM MgCl2， 0. 2 mM dNTP,各1 pmol/ti 1上、下游引物及 相应的探针，0.025 U/nlTag酶，混匀。PCR反应条件95°C5分钟；95'C30 秒，60'C1分钟(40个循环)；4'C5分钟。引物和探针序列如下 GAPDH:上游引物5'-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3 下游弓I物5，-CCTGCTTCACCACCTTCTTGA-3 探针序列5'-CCGCCTGGAGAAACCTGCCAAGTATG-3， UCP2: 上游引物5，一CCAATGTTGCCCGWAATG —3，，下游弓l物5'—TGAGGTTGGCTTTCAGGAG—3 探针序列5 ，-CTGGTGACCTATGACCTCATCAAAG-3 ， 结果用ABI Prism 7000 SDS Software分析，见附图。从附图可以看出，给药组小鼠肾脏中的UCP2的信使核糖核酸的表达量有显 著的降低，说明该知母提取物可以通过抑制小鼠基因UCP2的表达从而达到提高 胰岛素分泌进而改善胰岛素抵抗的效果。本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种知母提取物在制备改善胰岛素抵抗药物中的应用。
【技术特征摘要】
1.一种知母提取物在制备改...
【专利技术属性】
技术研发人员：姜晓宏，张辰宇，项阳，孙凌冰，张红杰，孙国勋，邹季虹，徐琛，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。