一种阿霉素－二肽复合物的制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种阿霉素－二肽复合物的制备方法，通过肽修饰技术，将含有脯氨酸残基的二肽或多肽通过酰化反应连接到阿霉素的氨基上，可以使阿霉素的毒性降低，同时这种前体药物在肿瘤间质细胞的作用下能释放阿霉素，使阿霉素能富集到肿瘤组织周围，提高阿霉素对肿瘤组织的选择性。本发明专利技术反应速率快，耗时短，产物产率和纯度较高。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物与医药
，具体涉及一种具有抗癌活性的 阿霉素-二肽复合物的制备方法和应用。
技术介绍
由于其广泛的抗肿瘤作用，阿霉素作为治疗癌症的一线药物常用 于肝癌、胃癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌和多种血癌等的临床治疗中。 然而，阿霉素的骨髓抑制和心脏毒性等不良反应往往破坏病人的免疫 功能，严重影响了治疗效果。因此，寻找一种降低阿霉素毒性、提高 阿霉素对肿瘤组织的选择性的修饰方法成为目前研究的重点之一。前体药物技术的一个核心是许多抗肿瘤小分子化学药物的结构 中含有可发生酰化反应的游离氨基，并且这些游离氨基往往影响着药 物的化学和生物学特性， 一旦被其他化学基团修饰或封闭，将导致药 物的细胞毒性显著降低，而去除修饰基团其细胞毒性则即可恢复。这些药物包括阿霉素(doxorubicin, Dox)、道诺霉素(daunomycin， DM)等等。Bairrain等制备了多个道诺霉素的多肽衍生物，结果发现， Ala-Leu-DM与Leu-Leu-DM的细胞毒性分别下降至母体药物DM的 1/100和1/250。而一旦水解去除多肽，DM的细胞毒性即可恢复 [Baurain R， et al. J Med Chem. 23 (11) :1171—4. 1980]。 Trouet 报道，阿霉素的四肽衍生物N-alanyl-leucyl-alanyl-leucyl-Dox对 正常小鼠及荷瘤小鼠的毒性仅为阿霉素的1/9[Trouet A， etal. Cancer Res. 61 (7) :2843-6. 2001.]分子靶向药物依据肿瘤细胞与正常细胞之间分子生物学上的差 异，选择性作用于靶细胞的基因、酶、信号传导分子等，从而达到治 疗的目的。虽然分子靶向药物治疗是一种理想的治疗方式，但单药使 用效果并不佳，尚存在许多问题。其中由于肿瘤细胞基因的不稳定性， 肿瘤细胞往往通过靶分子的调变或缺失逃避药物的攻击，致使分子靶 向药物失去疗效就是一个亟待解决的课题。近年来，研究者开始将目 光转向基因组稳定的肿瘤间质细胞。在肿瘤间质中，成纤维细胞通过 与肿瘤细胞相互作用而活化，这种活化成纤维细胞被称为肿瘤相关成 纤维细胞(Carcinoma-Associated Fibroblasts, CAF) [BhowmickNA， et al. Nature. 432(7015) :332-7. 2004.]。大量证据表明，CAF对 肿瘤的发生发展起着必要的支持促进作用，比如表达细胞因子、蛋白 酶及粘附分子等促进肿瘤浸润与转移[Tuxhorn JA， et al. Clin Cancer Res. 8(9) :2912-23. 2002.]。 鉴于CAF对于肿瘤发生发展 的重要性，选择这群细胞为靶标，切断其对肿瘤细胞的支持促进作 用，不失为提高肿瘤靶向治疗有效性的必要措施。现已发现，肿瘤相 关成纤维细胞含有多种水解第二位由脯氨酸残基形成的肽键的蛋白 酶，比如成纤维激活蛋白。这类蛋白酶通常存在于肿瘤组织，伤口愈 合组织，胚胎成纤维细胞[Niedermeyer J， et al. Int J CANCER. 71:383-389. 1997]，使肿瘤间质细胞具有与周围正常组织不同的特 性。但现有技术中，阿霉素-二肽复合物的制备方法一般耗时较长，反应速率较低，产物的产率和纯度也比较低。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种阿霉素-二肽复 合物的制备方法，弓i入可被肿瘤间质细胞表达的蛋白水解酶选择性水 解的二肽来修饰阿霉素。本专利技术的技术方案是提供一种阿霉素-二肽复合物的制备方法，包括以下步骤(1) 称取N-苄氧羰基甘氨酰脯氨酸(二肽)溶于N， N-二甲基甲酰胺(DMF)，加入氯甲酸乙酯，室温下搅拌，加入三乙胺，室温搅 拌，得到活化的二肽的溶液；(2) 盐酸阿霉素溶于含有与之等物质的量的Et3N的DMF，加入 活化的二肽溶液，室温搅拌，乙醚萃取反应产物，萃取液经旋转蒸发 制得阿霉素-二肽复合物；(3) 采用柱层析法对阿霉素-二肽复合物进行纯化。步骤(1)所述氯甲酸乙酯与N-苄氧羰基甘氨酰脯氨酸摩尔比为 1:1.2。步骤(l)所述所述加入氯甲酸乙酯后室温下搅拌时间为10分钟； 所述加入三乙胺后室温搅拌时间为40分钟。步骤(2)所述活化的二肽溶液的加入量为与盐酸阿霉素的DMF 溶液等摩尔比。步骤(2)所述室温搅拌时间为5 6小时。步骤(3)所述柱层析法的色谱条件为常规柱2.5X30 cm;固定 相为柱层析硅胶；流动相为7.5:1和5:1的乙酸乙酯-甲醇。产品通过薄层层析鉴定后，用高效液相色谱法(HPLC)检测纯度。本专利技术通过肽修饰技术，将含有脯氨酸残基的二肽或多肽通过酰 化反应连接到阿霉素的氨基上，可以使阿霉素的毒性降低，同时这种 前体药物在肿瘤间质细胞的作用下能释放阿霉素，使阿霉素能富集到 肿瘤组织周围，提高阿霉素对肿瘤组织的选择性。本专利技术的有益效果是(1) 本专利技术提供的制备方法制备出的阿霉素-二肽复合物具有两 方面的特点 一方面由于阿霉素氨基的封闭，阿霉素-二肽复合物比 其母药阿霉素的毒性降低；另一方面，阿霉素-二肽复合物在肿瘤间质细胞的蛋白水解酶的作用下释放出阿霉素，从而达到阿霉素被选择 性释放的富集功能，赋予了阿霉素-二肽复合物对正常组织低毒，对 肿瘤组织具有杀伤性作用的治疗效果。(2) 本专利技术的方法简单易行，反应速率高，耗时短，产物的纯 度和产率比较高。附图说明图1血桨稳定性实验结果 图2肿瘤生长曲线图3药物毒性实验中实验动物体重变化曲线具体实施方式下面结合附图和具体实施例来进一步说明本专利技术。实施例1苄氧羰基甘氨酰脯氨酰阿霉素的合成(1) N-苄氧羰基甘氨酰脯氨酸的活化称取26. 4 mg (86. 2 u inol)的N-苄氧羰基甘氨酰脯氨酸溶于1. 5 ml的N， N-二甲基甲酰胺(DMF)，加入9. 8 ul (86.2X1.2 = 103.4 umol)氯甲酸乙酯，室温下搅拌10分钟，加入14.5 ul (103.4 umol) 三乙胺，室温搅拌40分钟。(2) N-苄氧羰基甘氨酰脯氨酰阿霉素的制备称取40mg (86.2 u mol)盐酸阿霉素溶于1. 5 mL DMF中，向其 中加入12.5 ul (86.2 ymol)三乙胺并混匀。将溶解好的盐酸阿 霉素溶液加入经上述活化的Z-GP溶液，室温搅拌5 6小时；产物用 30 ml的乙醚(5倍于反应液体积)进行萃取，减压抽滤弃去沉淀， 乙醚萃取液经旋转蒸发即得粗品。(3) N-苄氧羰基甘氨酰脯氨酰阿霉素的纯化 采用柱层析法对粗产品进行纯化。色谱条件常规柱(2.5X30cm)。固定相柱层析硅胶；流动相乙酸乙酯-甲醇(7. 5: 1， 5:1)。 产品通过薄层层析鉴定，质谱确证(ES-MS : [M+K]+= 870)，用高效液 相色谱法(HPLC)检测纯度，纯度达98%。实施例2苄氧羰基甘氨酰脯氨酰阿霉素(Z-GP-Dox)体外细胞毒性 实验将K562， MOLT-4细胞接种在96孔板中，密度为10， 000/孔，将 含有0nM - 2nM的游离阿霉素或等摩尔浓度的Z-GP-Dox (溶剂是 DMS0)加到细胞中，或者将K562， MOLT-4细胞培养基本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种阿霉素－二肽复合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：（１）称取Ｎ－苄氧羰基甘氨酰脯氨酸溶于Ｎ，Ｎ－二甲基甲酰胺，加入氯甲酸乙酯，室温下搅拌，加入三乙胺，室温搅拌，得到活化的二肽的溶液；（２）盐酸阿霉素溶于含有与之等物质的量的Ｅｔ３Ｎ的ＤＭＦ，加入活化的二肽溶液，室温搅拌，乙醚萃取反应产物，萃取液经旋转蒸发制得阿霉素－二肽复合物；（３）采用柱层析法对阿霉素－二肽复合物进行纯化。

【技术特征摘要】
1、一种阿霉素-二肽复合物的制备方法，其特征在于包括以下步骤(1)称取N-苄氧羰基甘氨酰脯氨酸溶于N，N-二甲基甲酰胺，加入氯甲酸乙酯，室温下搅拌，加入三乙胺，室温搅拌，得到活化的二肽的溶液；(2)盐酸阿霉素溶于含有与之等物质的量的Et3N的DMF，加入活化的二肽溶液，室温搅拌，乙醚萃取反应产物，萃取液经旋转蒸发制得阿霉素-二肽复合物；(3)采用柱层析法对阿霉素-二肽复合物进行纯化。2、 根据权利要求1所述阿霉素-二肽复合物的制备方法，其特征 在于步骤(1)所述氯甲酸乙酯与N-苄氧羰基甘氨酰脯氨酸摩尔比为 1:1.2。3、 根据权利要求1所述阿霉素-二肽复合物的制备方法，其特征 在于步骤(l)所述所述加入氯甲酸乙酯后室温下搅拌时间为10分钟； 所述加入三...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜军，刘鹏，卜宪章，谢白露，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]