两亲聚合物-PDGF复合物制造技术

本发明专利技术涉及与两亲聚合物结合的血小板源生长因子（ＰＤＧＦ）的新型复合物，其可以改善用于药物应用的治疗性蛋白质的体外和体内物理和化学稳定性。本发明专利技术还涉及制备ＰＤＧＦ－两亲聚合物复合物的方法，其特征在于在含水介质中和在不存在可能导致蛋白质变性的有机溶剂的情况下制备这种聚合物／ＰＤＧＦ－ＢＢ复合物并涉及所述两亲聚合物－ＰＤＧＦ复合物用于制备通过局部途径治疗溃疡用的具有愈合作用的治疗性组合物的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及与两亲聚合物结合的血小板源生长因子(PDGF )的新型复合物，其可以改善用于药物应用的治疗性蛋白质的体外和体内物 理和化学稳定性。
技术介绍
PDGF类是通过经由两个二硫化物桥彼此连接的两个多肽链构成 的大约30 OOO道尔顿的糖蛋白类。已经识别出四种类型的链A、 B、 C和D。天然蛋白质以同二聚体或AB型异二聚体的形式存在(OefnerC. EMBO J.11， 3921-2926， 1992 )。PDGF最初分离自血小板。PDGF类是在血液凝结过程中释放出来 的能够促进各种细胞类型的生长的生长因子(Ross R等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1974，71， 1207; Kohler N. & Lipton A. ， Exp. Cell Res. ， 1974， 87， 297 )。已知的是，血小板以外的某些细胞也会 产生PDGF,其对于多数源自间叶细胞的细胞即血液、肌肉、骨骼和 软骨细胞以及结締组织细胞来说是促有丝分裂的(Raines E. W.， Biology of Platelet-Derivated Growth Factor (血小板源生长 因子生物学)，1993,Westermark， B.和C. Sorg， Ed. Basel, Kerger, 第74页)。许多文章往往也证实，巨噬细胞源PDGF对于平滑肌细胞 起到趋化和促有丝分裂剂的作用并且其有助于动脉硬化特有的动脉 壁的肌内膜增厚(Ross R等人，Science(科学)，1990， 248， 1009 )。 PDGF的活性此外还特别包括刺激嗜中性单核细胞的微粒释放(TzengD. Y等人，Blood (血液)，1985, 66, 179 )，促进间质细胞的类固醇 合成(Risbridger G. P. ， Mol. Cell, Endocrinol. ， 1993， 97， 125 )， 刺激嗜中性吞噬作用(WilsonE等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 1987, 84, 2213 )，调节凝血栓蛋白表达和分泌(Ma jak R. A等人，J.Biol. Chem.， 1987， 262， 8821 ),以及血管平滑肌细胞中ICAM-1基因 的后调节(Morisaki N等人，Biochem. Biophys. Res. Commun. ， 1994， 200, 612 )。由于这些不同性质，已经设想了重组PDGF类在制药领域中的应 用。PDGF已经特别#皮批准用于糖尿病足部溃疡的治疗(Regranex， J&J)和用于牙周4I^卜(GEM 21S，Biomimetic)。溃疡愈合，就像一般来说的皮肤愈合一样，是一种复杂的现象， 其要求许多细胞类型随时间和在空间上的协调干预，这可以概括为三 个阶段发炎阶段、增殖阶段和重塑阶段。在对正常愈合而言大约7天的发炎阶段中，巨噬细胞杀死细菌，清除受损组织并使组织再生。为此，巨噬细胞分泌出胶原酶、细胞因 子和生长因子。在对正常愈合而言从第3天到第三周的增殖阶段的过程中，相继 发生三个事件。伤口被肉芽组织填充，血管生成且伤口被上皮细胞覆 盖。肉芽组织从边缘向中心生长。成纤维细胞大量产生III型胶原。在从第3周到l甚至2年的重塑过程中，肉芽组织成熟，且成纤 维细胞产生较少胶原。通过细胞凋亡消除肉芽形成过程中形成的没用 的血管。III型胶原被I型胶原替代，其依照张力线組织和交联。在此过程中，PDGF起到基本作用。在伤口形成过程中，血小板 聚集并释放PDGF。 PDGF将嗜中性白细胞、巨噬细胞和成纤维细胞引 向伤口并且是有力的促细胞分裂剂。巨噬细胞和内皮细胞又合成和分 泌PDGF。 PDGF刺激成纤维细胞产生新的细胞外基质，基本是非胶原 化合物，例如葡胺聚糖和粘着蛋白(J.F.Norton等人，Essential practice of surgery (夕卜科基本实践)，Springer, 2003，第7章， 77-89)。慢性伤口例如糖尿病足部溃疡、静脉溃疡和压疮具有愈合非常緩 慢且有时不完全的特性，这是因为愈合过程不是正常进行(R. Lobmann等人，J. of Diabetes and its complications (糖尿病及 其并发症杂志)，2006， 20， 329-335 )。愈合过程实际上是消除对组织的损伤所必须的破坏过程与引起 新组织形成的修复过程之间的精妙平衡。蛋白酶和生长因子在此过程 中通过调节此平衡来发挥基本作用。在慢性伤口的情况下，这种平衡 向着有利于破坏的方向被扰乱，因此这些伤口的愈合緩慢。尽管存在 不同类型的慢性伤口，但是在它们以持续发炎阶段(这造成高的蛋白 酶含量并因此降低生长因子活性)为特征的意义上，它们在生物化学上相对类似(G. Lauer等人，J. Invest. Dermatol. 115 (2000) 12-18 )。 这种生长因子的劣化造成与这些慢性伤口有关的组织的整体损失，这 不利于愈合(D.R. Yager等人，J. Invest. Dermatol. 107 (1996) 743-748)。目前在市场上存在与国际非有产权名称becaplermin (贝卡普 勒明)对应的，以商品名Regranex⑧出售的人重组PDGF-BB-基药品。 这种药品用于糖尿病的下肢溃疡的治疗。其是局部施用的凝胶形式并 且能够促进溃疡愈合。其就像内源PDGF—样特别能够促进细胞增殖 并因此促进新组织的形成。这种治疗的效力有限(Cullen等人，The international journal of biochemistry & Cell Biology (国际生物化学与细胞生物学杂志) 34， 1544-1556， 2002 )，即使临床研究已经显示了在愈合和愈合所需 的时间周期方面的改进(Greenhalgh等人，American Journal of pathology (美国病理学杂志)，136， 1235-1246 1990; LadinPlastic and Reconstructive Surgery ( Ladin 整形和重建夕卜科 学)，105, 1230-1231 2000; Holloway等人，Wounds, 5/4， 198-206; Mandracchia等人，Clinics in Podiatric Medecine and Surgery (足病医学和外科学临床)，18， 189-209 2001; WiemanT. J. American Journal of Surgery (美国外科学杂志)，176， 74S-79S 1998 )。JT&J出售的含有PDGF-BB的Regranex产品已经通过将治疗的患 者的康复率提高至50%而证实了其效力，与之相比，仅接受标准伤口 治疗的患者的康复率仅为36°/。。尽管在糖尿病足部溃疡的治疗中具有 这种显著改进，但必须指出，只有50%患者在长期和昂贵的治疗后实现康复。在未康复的情况下，后果可能极其严重，在许多情况下则导 致下肢切除。应该补充的是，该治疗的平均持续时间非常长，大约本文档来自技高网...

【技术保护点】
水溶性的物理和化学稳定的两亲聚合物－ＰＤＧＦ复合物，其特征在于：－该两亲聚合物根据下列通式由用疏水取代基和亲水基团官能化的亲水聚合物骨架构成：＊＊＊　　ＤＰ＝ｍ个单体单元.Ｒ、Ｒ’是键或包含１至１８个碳的链，任选地支化和／或不饱和，包含一个或多个杂原子，例如Ｏ、Ｎ和／或Ｓ，Ｒ和Ｒ’彼此相同或不同.Ｆ、Ｆ’是酯、硫酯、酰胺、碳酸酯、氨基甲酸酯、醚、硫醚、胺，Ｆ和Ｆ’彼此相同或不同.Ｘ是亲水基团，其可以是：ｏ羧酸根ｏ硫酸根ｏ磺酸根ｏ磷酸根ｏ膦酸根.Ｙ是亲水基团，其可以是：ｏ硫酸根ｏ磺酸根ｏ磷酸根ｏ膦酸根.Ｈｙ是疏水基团，其可以是：ｏＣ↓［８］至Ｃ↓［３０］直链或支化烷基，任选不饱和和／或含有一个或多个杂原子，例如Ｏ、Ｎ或Ｓ，ｏＣ↓［８］至Ｃ↓［１８］直链或支化烷基芳基或芳基烷基，任选不饱和和／或任选含有杂原子，ｏＣ↓［８］至Ｃ↓［３０］多环，任选不饱和；ｎ和ｏ为１至３，ｈ代表疏水单元相对于单体单元的摩尔分数，其为０．０１至０．５，ｘ代表亲水基团相对于单体单元的摩尔分数，其为０至２．０，ｙ代表亲水基团相对于单体单元的摩尔分数，其为０至０．５；－ＰＤＧＦ从ＰＤＧＦ类（血小板源生长因子类）的组中选择。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】FR 2005-9-26 05/098031.水溶性的物理和化学稳定的两亲聚合物-PDGF复合物，其特征在于-该两亲聚合物根据下列通式由用疏水取代基和亲水基团官能化的亲水聚合物骨架构成DP＝m个单体单元·R、R’是键或包含1至18个碳的链，任选地支化和/或不饱和，包含一个或多个杂原子，例如O、N和/或S，R和R’彼此相同或不同·F、F’是酯、硫酯、酰胺、碳酸酯、氨基甲酸酯、醚、硫醚、胺，F和F’彼此相同或不同·X是亲水基团，其可以是ο羧酸根ο硫酸根ο磺酸根ο磷酸根ο膦酸根·Y是亲水基团，其可以是ο硫酸根ο磺酸根ο磷酸根ο膦酸根·Hy是疏水基团，其可以是οC8至C30直链或支化烷基，任选不饱和和/或含有一个或多个杂原子，例如O、N或S，οC8至C18直链或支化烷基芳基或芳基烷基，任选不饱和和/或任选含有杂原子，οC8至C30多环，任选不饱和；n和o为1至3，h代表疏水单元相对于单体单元的摩尔分数，其为0.01至0.5，x代表亲水基团相对于单体单元的摩尔分数，其为0至2.0，y代表亲水基团相对于单体单元的摩尔分数，其为0至0.5；-PDGF从PDGF类(血小板源生长因子类)的组中选择。2. 根据权利要求1的复合物，其特征在于PDGF从由含有两个B 链的人重组PDGF类(rhPDGF-BB)构成的组中选择。3. 根据前述权利要求任一项的复合物，其特征在于聚合物选自取 代基无规分布的聚合物。4. 根据前述权利要求任一项的复合物，其特征在于两亲聚合物选 自聚氨基酸。5. 根据权利要求4的复合物，其特征在于聚氨基酸选自聚谷氨酸 或聚天冬氨酸。6. 根据权利要求5的复合物，其特征在于聚氨基酸是均聚谷氨酸。7. 根据权利要求6的复合物，其特征在于聚氨基酸是均聚天冬氨酸。8. 根据权利要求7的复合物，其特征在于聚氨基酸是天冬氨酸和 谷氨酸的共聚物。9. 根据权利要求1至5之一的复合物，其特征在于该聚合物选自 多糖。10. 根据权利要求9的复合物，其特征在于多糖从由乙酰透明质 酸、藻酸盐、脱乙酰壳多糖、聚半乳糖醛酸、硫酸软骨素、葡聚糖、 纤维素构成的组中选择。11. 根据权利要求10的复合物，其特征在于纤维素的组由用酸官能化的纤维素如羧甲基纤维素构成。12. 根据权利要求10的复合物，其特征在于葡聚糖的组由用酸官能化的葡聚糖如羧甲基葡聚糖构成。13. 根据权利要求9的复合物，其特征在于多糖从由乙酰透明质 酸、藻...

【专利技术属性】
技术研发人员：G迪布勒克，L达里科雷亚，J科雷亚，D迪拉谢尔，R苏拉，O苏拉，G苏拉，
申请(专利权)人：阿道恰公司，
类型：发明
国别省市：FR[法国]