一种新的免疫荧光标记方法技术

一种新的免疫荧光标记方法。本发明专利技术分别合成了含有叠氮基团和炔基基团的两个关键化合物，将前者与抗体偶联获得叠氮化ＩｇＧ，再与含有荧光基团的后者进行点击化学反应，实现荧光显色。采用该技术，在细胞水平进行染色分析，叠氮标记抗体可有效应用于免疫荧光染色分析；并且采用本发明专利技术开发的方法标记的抗体可与其他现有的免疫荧光技术同时使用，且结果互不干扰。本发明专利技术通过开发一种新型的抗体标记技术，建立了一种新的免疫荧光抗体分析方法，丰富了免疫荧光抗体检测手段，在未来的免疫研究中具备发展潜力和广泛应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于免疫学技术应用领域，涉及通过点击化学进行免疫荧光染色分析的 方法。
技术介绍
点击化学是通过小单元的拼接，来快速可靠地完成形形色色分子的化学合成。 它尤其强调以碳-杂原子键(C-X-C)合成为基础的组合化学新方法，并借助该反应来 简单高效地获得分子多样性.由于点击化学产物无毒，且稳定性好，已被广泛用于药物 筛选、药物开发、聚合及其它生物体外和体内分析。生物偶联技术是通过小分子化合物对生物大分子进行修饰的一种技术，已经在 分子生物学和化学生物学等领域广泛的应用，如蛋白质、核酸等荧光团标记、修饰、配 体螯合、放射性同位素标记等。免疫荧光抗体技术是使用一个特殊的荧光标记物共价连接到任何一种抗原或抗 体，并通过荧光显微镜进行检测的方法。目前，FITC、罗丹明等荧光标记物已经广泛应 用于免疫荧光分析技术中，此外，利用生物素-亲和素系统的免疫检测系统，也被广泛 应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是开发的一种新型的抗体标记技术，建立了一种新的免疫荧光抗 体分析方法，丰富了免疫学检测体系和荧光抗体检测手段，为现有的方法提供一种新的 免疫荧光标记方法及其应用。本专利技术首先提供了一种新型免疫荧光标记方法，该方法包括以含有活化氨基基团和叠氮基团的双功能化合物作为蛋白质标记物，其中的活化氨 基基团能与蛋白质中的氨基反应，从而使被标记蛋白质含有叠氮基团，进而通过叠氮活 性基团与叠氮反应基团之间的点击化学反应，使蛋白质具备发光功能或偶联可被检测的 标签基团。所述的叠氮反应基团是能与叠氮基团形成三唑环的炔基化合物，其具备发荧光 特性或含有标签基团。所述的具备发荧光特性的偶联基团包括Cy3、Cy5、FITC、TRITC、ΡΕ、 DAPI、Texas red、RB200、Indo-1 和量子点等。所述的标签基团包括His、GST、FLAG、HA、Myc生物素等。本专利技术同时提供了一种新型免疫荧光标记方法在抗体的荧光标记及免疫荧光分 析方法中的应用。本专利技术涉及两个关键的化合物6-叠氮-己酸琥珀酰亚胺活性酯(化合物1)和 4-乙炔基-N-乙基-1,8-萘酰亚胺合成(化合物2)，将合成的化合物1与抗her2抗体Anti-HP15的游离氨基偶联获得叠氮化IgG，随后通过铜离子催化化合物2中的炔基与标 记抗体的叠氮基团进行点击化学反应，实现荧光显色，其检测限可达0.1 μ g，EC50为1 yg，并在细胞水平进行荧光染色分析验证。本专利技术自行合成了化合物6-叠氮-己酸琥珀酰亚胺活性酯(化合物1)和4-乙 炔基-N-乙基-1,8-萘酰亚胺合成(化合物2)，前者拥有与氨基高活性反应的琥珀酰亚 胺基团和与炔基反应的叠氮基团，后者含有炔基及发光基团。以上述合成的两个化合物，本专利技术建立了以抗体为代表的荧光染色分析方法， 并通过细胞的免疫荧光染色和点击化学方法进行验证，同时确认了该标记方法的检测灵 敏度和检测限。本专利技术提供的抗体的叠氮标记方法如下将2.4 μ L的10 mg/mL的化合物1缓慢加入到1 mL的Anti_HP15抗体溶液(0.1 mol/L, pH=9.0 Na2CO3-NaHCO3, 1 mg/mL IgG)中，室温搅拌 Ih 后，5000 r/min 离心 IOmin,吸取上清液加入超滤管中，以PBS稀释并于3500r/min反复离心洗涤，获得叠氮 标记的Anti-HP 15抗体。本专利技术提供的点击化学催化反应及荧光基团分析方法如下将0.1 1.0 mmol/L的化合物1加入至含有0.5 mmol/L化合物2、0.2 mmol/L Tris-triazoleamine、1 mmol/L CuSO4 及 2 mmol/L 抗坏血酸钠的 PBS 溶液中，室温反应 60 min。以365 nm波长激发光激发反应产物，扫描390 550 nm的发射光谱，确认最大发 射波长，并以最大发射波长测定各组荧光强度，绘制叠氮基团浓度相关的标准曲线；同 时，以3 ymol/L叠氮标记的Anti_HP15抗体替代化合物1进行点击化学反应，根据反应 产物的荧光强度确认抗体的叠氮化标记效率。本专利技术的有益效果本专利技术采用叠氮标记抗体进行免疫荧光分析，该专利技术可与其他 现有的免疫荧光技术同时使用，且结果互不干扰。本专利技术通过开发一种新型的抗体标记 技术，建立了一种新的免疫荧光抗体分析方法，丰富了免疫荧光抗体检测手段，在未来 的免疫研究中具备发展潜力和广泛应用前景。附图说明图1是依赖点击化学的免疫荧光分析原理； 图2是最大发射波长分析，A化合物1与化合物2反应后的产物；B化合物2 ； C :化合物1 图3是叠氮定量曲线； 图4是叠氮标记抗体的检测灵敏度； 图5是细胞染色分析，A 阴性对照；B 反应组；C 阳性对照； 图6是三通道荧光染色分析，A 叠氮标记Her2抗体染色；B: FITC标记的EGFR4染色；C:生物素化的GRP94染色；D 三通道复合分析。具体实施例方式实施例1 Anti-HP 15的荧光标记将1 mg NHS-FITC或NHS-罗丹明溶解于100 μ L DMSO中，随后吸取4.7 μ L NHS-FITC 或 3.5 μ L NHS-罗丹明逐滴加入 1 mL Anti-HP 15 抗体溶液(0.1 mol/L， pH=9.0 Na2CO3-NaHCO3, 1 mg/mL IgG)中，于室温下搅拌 1 h 后，5000 r/min 离心 10 min,吸取上清并于 PBS (pH=7.2, 0.02 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4, 0.15 mol/L NaCl)中充分透析，去除未反应的NHS-FITC和NHS-罗丹明，获得FITC或罗丹明标记的 Anti-HP 15抗体，用于阳性对照。实施例2 关键化合物的合成两个关键的化合物6-叠氮-己酸琥珀酰亚胺活性酯(化合物1)和4-乙炔基-N-乙 基-1,8-萘酰亚胺(化合物2)合成方法如下将6-溴化己酸与叠氮化钠在乙腈溶液中反 应，收集产物，向其中加入N-羟基琥珀酰亚氨和EDC，在二氯甲烷体系中反应，获得化 合物1;向4溴-1,8-萘酰亚胺中加入乙胺，在乙醇溶液中反应后收集产物，加入三甲基 硅烷基炔，在四氢呋喃体系中经四(三苯基膦)钯和碘化亚铜催化反应，获得化合物2。实施例3 Anti-HP 15的叠氮标记将2.4 μ L的10 mg/mL的化合物1缓慢加入到1 mL的Anti_HP15抗体溶液(0.1 mol/L, pH=9.0 Na2CO3-NaHCO3, 1 mg/mL IgG)中，室温搅拌 Ih 后，5000 r/min 离心 IOmin,吸取上清液加入超滤管中，以PBS稀释并于3500r/min反复离心洗涤，获得叠氮 标记的Anti-HP 15抗体。实施例4 抗体叠氮标记量分析将不同浓度的化合物1加入至含有0.5 mmol/L化合物2、0.2 mmol/L Tris-triazoleamine、1 mmol/L CuSO4 及 2 mmol/L 抗坏血酸钠的 PBS 溶液中，室温 60 min后，以365 nm波长激发光激发反应产物，扫描390 550 nm的发射光谱，确认最大发射波 长，并以最大发射波长测定各组荧光强度，绘制叠氮基团浓度相关的标准曲线；同时， 以3 1101本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种新的免疫荧光标记方法，其特征在于：以含有活化氨基基团和叠氮基团的双功能化合物作为蛋白质标记物，其中的活化氨基基团能与蛋白质中的氨基反应，从而使被标记蛋白质含有叠氮基团，进而通过叠氮基团与叠氮反应基团之间的点击化学反应，使蛋白质具备发光功能或偶联可被检测的标签基团。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张奇，白钢，侯洁，白芳，高智慧，潘鹏炜，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：12