Boc和Fmoc固相肽合成制造技术

本发明专利技术公开了一种利用Ｂｏｃ和Ｆｍｏｃ保护的氨基酸两者及氯甲基化的聚苯乙烯树脂合成包含三个或更多个氨基酸残基的肽的固相方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种制备包含三个或更多个氨基酸残基的肽的方法， 所述肽具有N-端氨基酸、邻近该N-端氨基酸的倒数第二个氨基酸和 C-端氨基酸。
技术介绍
为了克服与溶液肽合成有关的许多中间体提纯问题，于1963年引 入固相肽合成。Stewart等人，固相肽合成(Solid Phase Peptide Synthesis)(百克化学公司(Pierce Chemical Co.),第2版，1984)。在固相合成期间，氨基酸被组装(即，偶联)成任何想得到的序列的肽，而链的 一端(即，C-端)被锚定到不能溶解的载体上。 一旦在载体上将想得到的 序列连接到一起，那么肽就被从载体中解封闭(deblock)(即，裂开 (cleave))。偶联氨基酸的a-氨基官能团的这两个标准保护基团为通过利 用强酸处理而除去的Boc，以及利用碱除去的Fmoc。本专利技术涉及一种 利用这些a-氨基保护基团两者的组合，以单一合成，在便宜的氯甲基 化的聚苯乙烯树脂上制备肽的便利方法。在通过利用任一种上面提及的a-氨基保护方案的固相方法合成肽 的设计中，重要的是在整个链组装期间保护构成氨基酸的任何反应性 "侧基"不发生不希望的化学反应。还希望选择来保护各种侧基的化 学基团可耐受被用来除去a-氨基保护基团的试剂除去。第三，重要的 是在链组装期间生长中的肽链与树脂颗粒的连接对于用来除去任一类 型a-氨基保护基团的试剂稳定。在Fmoca-氨基保护方案的情况下，侧 基保护官能团应当可耐受用来除去Fmoc的碱性试剂。实际上，在肽链 组装之后，这些侧链保护基团一般由温和酸性试剂除去。当利用Boca-氨基保护方案时，侧链保护基团必须在每一个循环中都可耐受被用来脱保护Boc基团的温和酸试剂除去。实际上，在肽链组装之后，Boca-氨基保护方案的这些侧链保护基团一般由无水HF除去。因此，实际上， 就Fmoc a-氨基保护而言常用的侧链保护基团在用于Boc a-氨基脱保护 的条件下不稳定，并且这两个类型的a-氨基保护方案未在通过固相肽 合成的肽链的组装中混合。另外，尽管就Boc保护的氨基酸而言广泛 地使用了用于肽合成的最不昂贵的聚合树脂，氯甲基化的苯乙烯或 "Merrifield树脂"，但是文献暗示就在a-氨基上的Fmoc保护而言由 于其在碱性条件下的不稳定性而不适于使用。(参见Stewart等人，固相 肽合成(百克化学公司，第2版，1984)。本专利技术涉及在某些肽的固相合 成期间在"Merrifield树脂"上混合使用Boc和Fmoc氨基酸两者的方 法。Lanreotide②(兰瑞肽)为生长抑素的类似物并且已知抑制生长激素 释放以及抑制胰岛素、胰高血糖素和胰腺外分泌。美国专利号4853371公开并要求保护Lanreotide⑧、其制备方法及 抑制生长激素、胰岛素、胰高血糖素的分泌和胰腺外分泌的方法。美国专利号5147856公开了 Lanreotide⑧治疗再狭窄的用途。 美国专利号5411943公开了 Lanreotide⑧用于治疗肝细胞瘤的用途。美国专利号5073541公开了 Lanreotide⑧用于治疗肺癌的用途。于1993年7月9日提交的美国申请号08/089410公开了 Lanreotide 用于治疗黑色素瘤的用途。美国专利号5504069公开了 Lanreotide⑧用于抑制实体瘤加速生长的用途。于1997年5月13日提交的美国申请号08/854941公开了 Lanreotide⑧用于降低体重的用途。于1997年5月13日提交的美国申请号08/854943公开了 Lanreotide⑧用于治疗胰岛素抵抗和综合征X的用途。美国专利号5688418公开了 Lanreotide⑧用于延长胰腺细胞生存的 用途。PCT申请号PCT/US97/14154公开了 Lanreotide⑧用于治疗纤维化 的用途。于1997年5月13日提交的美国申请号08/855311公开了 Lanreotide 用于治疗高脂血症的用途。于1995年5月12日提交的美国申请号08/440061公开了 Lanreotide 用于治疗血淀粉酶过多(hyperamylinemia)的用途。于1997年5月7日提交的美国申请号08/852221公开了 Lanreotide⑧用于治疗高催乳素血症和催乳素瘤的用途。前面的专利和专利申请的内容并入本文中作为参考。
技术实现思路
本专利技术特征在于一种用于制备包含三个或更多个氨基酸残基的肽 的方法，该肽具有N-端氨基酸、邻近该N-端氨基酸的倒数第二个氨基 酸和C-端氨基酸，其中所述方法包括如下步骤(a)通过酯键把第一氨基酸连到固体载体树脂上以形成第一级偶 联产物，其包括(i)使碳酸铯的水溶液与第一氨基酸的醇溶液反应，以形成第一氨基酸的铯盐，(ii)获得第一氨基酸的无溶剂铯盐，(iii)在干 的极性非质子溶剂中使固体载体树脂与第一氨基酸的铯盐反应，以形 成第一级偶联产物；其中第一氨基酸与肽的C-端氨基酸对应，第一氨基酸的非侧链氨 基被Boc封闭并且第一氨基酸没有需要保护的侧链官能团，以及固体 载体树脂为氯甲基化的聚苯乙烯树脂；(b) 利用酸从第一级偶联产物中解封闭Boc，以形成第一级解封闭 的偶联产物；(c) 任选地把下一个氨基酸偶联到第一级解封闭的偶联产物上，其 包括在包含肽偶联试剂的有机溶剂中使下一个氨基酸与第一级解封闭 的偶联产物反应，以形成下一级封闭的偶联产物，其中下一个氨基酸 具有被Boc封闭的非侧链氨基，并且如果下一个氨基酸具有一个或更 多个侧链官能团，那么侧链官能团不需要保护，或者侧链官能团具有 对于分别用来解封闭Boc和Fmoc的酸试剂和碱试剂稳定的保护基团；(d) 从下一级封闭的偶联产物中解封闭Boc，其包括使下一级封闭 的偶联产物与酸反应，以得到下一级解封闭的偶联产物；(e) 任选地重复步骤(c)和(d)，每个循环形成(X+1)级的下一级解封 闭的偶联产物，其中X为所需的循环重复次数；(f) 把下一个氨基酸偶联到得自(b)的第一级解封闭的偶联产物上， 或者任选地偶联到得自(e)的(X+l)级的下一级解封闭的偶联产物上，其 包括在包含肽偶联试剂的有机溶剂中使下一个氨基酸与所述第一级解 封闭的偶联产物或所述(X+1)级的下一级解封闭的偶联产物反应，以形 成下一级封闭的偶联产物，其中下一个氨基酸具有被Fmoc封闭的非侧 链氨基，条件是如果下一个氨基酸具有一个或更多个侧链官能团，那 么侧链官能团不需要保护，或者侧链官能团具有对于用来解封闭Fmoc 的碱试剂稳定的保护基团；(g) 从下一级封闭的偶联产物中解封闭Fmoc，其包括使下一级封 闭的偶联产物与伯胺或仲胺反应，以得到下一级解封闭的偶联产物；(h) 任选地重复步骤(f)和(g)，每个循环形成(X+1)级的下一级解封 闭的偶联产物，其中X为所需的循环重复次数，直到肽的倒数第二个氨基酸被偶联和解封闭；(i)把N-端氨基酸偶联到(X+1)级的下一级解封闭的偶联产物上， 其包括在包含肽偶联试剂的有机溶剂中使N-端氨基酸与(X+1)级的下 一级解封闭的偶联产物反应，以形成完成的封闭的偶联产物，其中N-端氨基酸具有被Boc或Fmoc封闭的非侧链氨基；(j)从完成的封闭的偶联产物中解封闭Boc或Fmoc本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于制备包含三个或更多个氨基酸残基的肽的方法，该肽具有Ｎ－端氨基酸、邻近该Ｎ－端氨基酸的倒数第二个氨基酸和Ｃ－端氨基酸，其中所述方法包括如下步骤：　（ａ）通过酯键把第一氨基酸连到固体载体树脂上，以形成第一级偶联产物，其包括（ｉ）使 碳酸铯的水溶液与第一氨基酸的醇溶液反应，以形成第一氨基酸的铯盐，（ｉｉ）获得第一氨基酸的无溶剂铯盐，（ｉｉｉ）在干的极性非质子溶剂中使固体载体树脂与第一氨基酸的铯盐反应，以形成第一级偶联产物；　其中第一氨基酸与肽的Ｃ－端氨基酸对应，第 一氨基酸的非侧链氨基被Ｂｏｃ封闭并且第一氨基酸没有需要保护的侧链官能团，以及固体载体树脂为氯甲基化的聚苯乙烯树脂；　（ｂ）利用酸从第一级偶联产物中解封闭Ｂｏｃ，以形成第一级解封闭的偶联产物；　（ｃ）任选地把下一个氨基酸偶联到第一 级解封闭的偶联产物上，其包括在包含肽偶联试剂的有机溶剂中使下一个氨基酸与第一级解封闭的偶联产物反应，以形成下一级封闭的偶联产物，　其中下一个氨基酸具有被Ｂｏｃ封闭的非侧链氨基，并且如果下一个氨基酸具有一个或更多个侧链官能团，那么侧链官 能团不需要保护，或者侧链官能团具有对于分别用来解封闭Ｂｏｃ和Ｆｍｏｃ的酸试剂和碱试剂稳定的保护基团；　（ｄ）从下一级封闭的偶联产物中解封闭Ｂｏｃ，其包括使下一级封闭的偶联产物与酸反应，以得到下一级解封闭的偶联产物；　（ｅ）任选地 重复步骤（ｃ）和（ｄ），每个循环形成（Ｘ＋１）级的下一级解封闭的偶联产物，其中Ｘ为所需的循环重复次数；　（ｆ）把下一个氨基酸偶联到得自（ｂ）的第一级解封闭的偶联产物上，或者任选地偶联到得自（ｅ）的（Ｘ＋１）级的下一级解封闭的偶联产物上 ，其包括在包含肽偶联试剂的有机溶剂中使下一个氨基酸与所述第一级解封闭的偶联产物或所述（Ｘ＋１）级的下一级解封闭的偶联产物反应，以形成下一级封闭的偶联产物，其中下一个氨基酸具有被Ｆｍｏｃ封闭的非侧链氨基，条件是如果下一个氨基酸具有一个或更多个侧链官能团，那么侧链官能团不需要保护，或者侧链官能团具有对于用来解封闭Ｆｍｏｃ的碱试剂稳定的保护基团；　（ｇ）从下一级封闭的偶联产物中解封闭Ｆｍｏｃ，其包括使下一级封闭的偶联产物与伯胺或仲胺反应，以得到下一级解封闭的偶联产物；　 （ｈ）任选地重复步骤（ｆ）和（ｇ），每个循环形成（Ｘ＋１）级的下一级解封闭的偶联产物，其中Ｘ为所需的循环重复次数，直到肽的倒数...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：凯瑟琳菲奥纳多尔顿，约翰斯图尔特艾农，史蒂文艾伦杰克逊，加里亚历山大西夫吕克，
申请(专利权)人：爱尔兰伊普森制造有限公司，
类型：发明
国别省市：IE[爱尔兰]