用于提高抗体产量的方法技术

本发明专利技术包括抗体变体比如ｈｕＣ２４２的变体、或其片段的制造，其中，通过取代一个以上亲代抗体中的氨基酸残基来制造变体。这种取代优选在包含重链和轻链的亲代抗体的可变区构架序列中进行。这种取代的结果是，当被导入寄主细胞中时，与亲代抗体相比，变异的抗体或其片段显示出增强的抗体合成性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及提高抗体产量的方法。更具体地说，涉及基因工程重新改造抗体的方法， 以使得在寄主细胞中产生的基因工程再造抗体的产量相比基因工程再造抗体的亲代抗体 产量更大。
技术介绍
单克隆抗体具有各种各样的应用，包括体外诊断、实验室试剂、以及治疗。当前， 有至少200种经历临床试验的抗体或抗体片段(Morrow, K. J., Jr.,单克隆抗体生产技术， Gen. Eng. News, 2002, 20(14): 21 )。在CHO细胞中高水平表达抗体要求从转录到转译和分泌的最佳效力。通过使用有潜 力的病毒增强子如hCMV立即早期基因增强子(immediate &arly gene enhancer)和启动子 序列与转录稳定的聚腺苷酸化信号如SV40 poly A位点一起，哺乳动物表达质粒主要地l皮 设计成能达到较高的mRNA水平。合成的cDNA构建体能够被设计成能通过删去抗体编 码序列内隐蔽剪接位点及其他潜在的不利的顺式元件来更进一步增强mRNA水平。此外， 通过最佳的密码子使用并且通过最小化mRNA 二级结构能量，合成的构建体可以增强基因 翻译机(TrinhR， GurbaxaniB， MorrisonSL， SeyfzadehM，在(GGGGS)3连结物序列内密码子对使用的优化导致提高的蛋白质 表达，Mol Immunol., 2004年1月；40 (10) : 717-22)。然而，即使使用这样优化的表 达系统，在哺乳动物细胞中的表达水平在不同的抗体当中也能够发生显著变化。从表达质 粒中合成抗体分子所需的不同细胞阶段的分析导致抗体可变区性状能够影响给定抗体表 达水平的观念。然而，人们很少知道序列特性和可变区结构不论转录或转译效率如何都能 够影响基因表达。许多来源于特定次级的可变区基因的抗体是生物物理学地倾向于可能导致低基因表 达的很小的稳定性。根据人类scFv噬菌体文库的分析，人类轻链和重链可变区能够被分类成具有不同程度结构稳定性的亚组(EwertS， HoneggeA， PlilckthuA，用可归纳的方法进 行的免疫球蛋白VH结构域生物物理学性状的基于结构的改进，Biochemistry, 2003年2 月18日；42 (6) : 1517-28)。属于具有很小稳定性的成员的亚群的抗体或片段可以具有 聚集倾向，并且由于无效的折叠或装配而可能难以表达。进一步的，在一些过程如折叠和分泌中扮演关键角色的残基经常在种系序列中高度 保守，但是在最初抗体库的传代以及经过体细胞突变的亲和力成熟期间可以被改变。这可 能会导致稳定性很小并且低表达的抗体。单一残基变化能够显著地改变陪伴结合性或轻链 /重链装配并且导致最终被降解的胞内未配对重链的增加(DulJL, Argon Y.在轻链可变区 中单一氨基酸置换尤其会阻断免疫球蛋白分泌。Proc Natl Acad Sci USA. 1990年10月； 87(20):8135-9; Wiens GD, Lekkerkerker A， Veltman I, Rittenberg MB,在VH互补性确定区2 中单一保守残基的突变导致严重的Ig分泌缺陷。J Immunol., 2001年8月15日；167 (4): 2179-86)。其他的去稳定化突变包括导入隐蔽的疏水残基或表面疏水残基。无变化的核心 填充残基如Glu 6/Gln 6的重链也对邻近位置如H7和H10的残基变化敏感(Honegger A， PlUckth皿A，在第6位隐蔽的谷氨酰胺或谷氨酸盐残基对免疫球蛋白可变区结构的影响。 JMolBiol.， 2001年6月8日；309 (3) : 687-99)。只要体细胞突变不与关键的结构性 阈值界限交叉，许多不符合生物物理学需要的序列能够在天然产生的抗体中被发现。 多数抗体的稳定性和表达潜力能够用合理的序列基因工程再造方法增强。最简单的 实现基因工程再造抗体的方法之一是，利用存在于有数千个抗体序列的数据库中的信息(参见，例如，JohnsonG,WuTT.Kabat数据库及其应用未来的方向，2001年1月1日； 29 (1) : 205-6.)。仔细的分析或许可以识别可能有问题的残基。举例来说，在给定位置 很少被发现的个别残基能够被改变以匹配用于该位置的共有序列残基从而提高稳定性(SteipeB， Schiller B， Pliickthun A， Steinbacher S.序列统计学可靠地预测在蛋白质结构 域中稳定化的突变体，JMolBiol.， 1994年7月15日;240 (3) : 188-92.)以及在哺乳动 物细胞系中的表达(WhitcombEA， MartinTM， RittenbergMB, Ig分泌物的复原在T15L 链中种系编码的残基的变异导致游离轻链的分泌以及承受有损分泌物的重链的装配的抗 体络合物，J Immunol., 2003年2月15日；170 (4) : 1903-9)。生物物理学攻击性的残 基例如疏水表面残基的识别和逆转也会导致提高的表达(NiebaL， HorieggerA， KrebberC， PlfickthunA，疏水小块在抗体可变/恒定结构域界面处的断裂基因工程scFv片段的改进 的体内折叠和物理特性，Protein Eng， 1997年4月；10 (4) : 435-44)。目前可用于支 撑生物物理学稳定的抗体的合理再设计的大多数数据已经随着在细菌性表达的噬菌体展7示系统中的抗体片段而产生(EwertS， HoneggerA， PKickthunA.用于胞外和胞内应用的 抗体的稳定性提高对稳定的构架和基于结构的构架基因工程的CDR嫁接，Methods, 2004 年10月；34 (2) : 184-99，综述)。在任何可能的情况下通过简单地从更稳定的种系亚群之一挑选人类供体可变区构 架，通过CDR嫁接技术进行的人源化能够固定或者避免这些稳定性问题(Ewert等，2004， 参见前述)。WO 2004/065417提供了一种进一步改进的方法，其通过将抗体可变域的高变 区l (HVR1)和/或高变区2 (HVR2)氨基酸序列与每一人类可变域亚群共有氨基酸序列 中相应的HVR1和/或HVR2氨基酸序列相比较，并且选择与可变域的HVR1和/或HVR2 氨基酸序列具有大多数序列一致性的亚群共有序列，在哺乳动物细胞培养物中以更高产率 来生产这种抗体和/或抗原结合片段。在WO 2004/065417中，共有序列源自于具有最相同 的HVR1和域HVR2的抗体，并且被应用于嫁接CDR的抗体，其中所有的构架序列是完 全的人类序列。其他的人源化方法，例如啮齿动物抗体表面重修(resurfacing)方法(美国专利No. 5,639,641; Roguska MA， Pedersen JT， Keddy CA， Henry AH， Searle SJ， Lambert JM， Goldmacher VS， Blattler WA， Rees AR， Guild BC.通过可变域表面重修的鼠科单克隆抗 体的人源化。Proc Natl Acad Sci USA. ， 1994年2月1日；91 (3) :969-73; 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于通过序列基因工程再造来提高寄主细胞中人源化鼠抗体或其片段的产量的方法，其包含：　ａ）比对鼠抗体可变区构架序列的集合，其中，这种比对可以识别在所述构架中各个位置处出现最频繁的氨基酸残基（共有序列残基）；　ｂ）将所述共有序列 残基与人源化抗体可变区构架序列中的相应残基相比较；　ｃ）在所述人源化抗体中识别可变区构架序列中一个以上非共有序列氨基酸残基；以及　ｄ）在所述人源化抗体或其片段中用等效位置处的共有序列残基取代一个以上非共有序列氨基酸残基，以产生变 异的抗体，其中在所述寄主细胞中以与所述人源化抗体相比更高的产率来生产所述变异的抗体；以及　ｅ）任选地，出于生物物理学考虑，用非共有序列残基取代一个以上氨基酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：周晓迈，丹尼尔塔瓦雷斯，
申请(专利权)人：免疫基因公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]