提供了用于定量实时分析荧光样品的方法，其中，所述样品中的每一个被样品单用光源（１２）激励而发荧光，并且测量样品发射的光的强度。为减少分析时间，为了即使在光强度低时也进行高度精确的测量，每个光源（１２）在所定义的间隔期间通过具有恒定脉冲频率的时钟脉冲序列交替地打开和关闭。仅仅在所述光源（１２）的开启阶段进行对这些间隔期间的发射光强度的测量。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及才^^U'J^求1前孕部分所述的用于定量实时分析荧i^羊品的方法和装置。
技术介绍
与聚^H^A/^，即所谓的PCR (Polymerase Chain Reaction)相结合， 该方法尤其用在临床诊断中，以确定DNA(lJt!U亥糖核酸)的量。##>^的循 环，为了分别净id制或扩增，利用作为勤台DNA的引物(primer)以及与引物 结合的核苷酸，DNA^^样品在循环的第一步内^^口热到95。C,从而使DNA 的互补链变性。通过在循环的第二步将温度降低到55°C，发生杂交 (hybridization),其中，引物结合到DNA上。^环的第三步，样品^^口热 到72。C。在该工作温度下，聚^H进一步将核苷酸H^到生长的DNA ， 并且引物和那些DNA片断之间的不完全互补的+^ft^合(loose bond)再次断 开。在由所ii^个循环步^i且成的循环的永久重复中，械复制的DNA分子的数 量在每#的循环内加倍。为了确定所形成的DNA分子，样品被提供有例如溴化乙4t(EtBr)的染料， 如果所述染^#合到双链DNA分子上并且如果用M励的话，则U荧光的。 根据荧光发射的光强度能够得出所形成的DNA量。才M^"种用于分冲射羊品的已知分析方法(EP0902271 A2)，来自多个光源的 光分别经由相同数量的光^故引导到一个样品上。由于在与样品,皮光源激励的 那些时间相对应的连续时间内因焚光性引起的光的^^力，因》傳个所述的样品 都发出光。为检测由多个样品发出的光量(即所谓的光强度)，使用了单个向其中导入了许多始于样品的光纤的iie^^则器。因此，^^]叉状光纤，所絲纤提供了一个主干，并JL^i干分出两个分支。所^X状光纤中的[个都通过其 主干被分酉^'j样品，同时一个分5U^酉e^光源并且另一个分叉位于光检测器处。位于^^测器处的所有的所述分X^都通it^接ll(章鱼式连接器辨4^来。绿色滤光^f立于具有多个分X^端的连接器出口和it^则^间。具有来自于JiJbbi普的波长的LED净M作光源。作为^^则器，^^fM^U文大器 阀，即所谓的光电倍增管(PM)。光电倍增管产生相当"f^f^则的光的强度的电 信号。所述电信号被储存在微控制器中。光源分别似欠开启持续预;WI瓶并 且独立地储存样品的光强yli:到所有的光源都已经被开启一次。随后，从第一光源开始，通iW所有光源扭^^斤的顺序启动而重复测量序列。当将所测的强度相对于测量的次数作图时，对每个样品的多次测量便产生一^4中形曲线。在最大值的80%处，才財^^个样品的测量次数确定例如包含在样品中的DNA数 量。一种已知的用于检测并测量由荧光引起的it^射的荧光计(WO 01/35079 Al)(其尤其是和基于PCR的研究关^f吏用)，具有多个光源(舰为^t^4及 管LED)，用于照明包含在小容器中的样品；具有位于每个LED及其分配的容 恭t间的第一光路，以及位于每个絲和在样品^^t励而发荧光的情况下用于 感测样品引起的光辐射的光电装置之间的第二光路。作为光电装置，使用M 放大器阀(所谓的光电倍增管)和CCD相机，当翻欠每个光子时it^U文大器阀 产生电荷或信号乐P中。借助于所述荧光计，实施用于分析PCR扩增的材料的方 法，从而使^4皮PCR扩增的样品被填^'J絲内，所述祥tJM^欠^/斤述LED 照射，并且由所述光电装置检测所述样品由于荧光而发出的光，而且将测量的光量，即光强^:与预定的^^考值ii^亍H^为了获得可靠的分析结果，测量需要足够高的光强度；这是因为对较小光 强度的测量严重地受到噪声的干扰，尤其是当光电倍增管用作光检测器时，测 量严重地受到石i^t声、电^电感干扰、电源电压波动等的干扰。为获M够 高的光强度，从而例如确定DNA (例如在PCR中)的量，需要其中DNA被 复制的多次重复循环，使#^析通常是非常费时的。
技术实现思路
本专利技术的目的是^iih面彬'j的方法，从而能够非常精确地测量很小的光 强度，以减少用于实现可靠的分析所需的周期。才^本专利技术，通it^i]^求l的特征实JJUi述目的。才M居;^专利技术的方法的优点在于，通#所定义的时间间隔内周期性的开启间测量由样品发出的光的强度，而不^^则出J脉光源的关闭阶M休止阶段中的那些干扰信号和出现的噪声；H因为不具有与时钟乐辦序列相同的频率和/ 或相位的所有干扰J^D虑除，并JL^"光强度的测量不起作用。每个周期的时钟 脉冲IW高，所实现的干拔滤除lfc^。结果，在较低的光强度下获得的4^ 寸t喿比已狄够好，从而使得对^R^t强度的电信号的可靠^H古成为可能。总 之，从开始到存在儈喿比的时间点的周期(其允^ii行可靠的测量)，被才財居本 专利技术的方法极;W^短，并且由此分析方法所需的时间周期^jU^减少。利要求2画9中进一步阐1才娥械明的一种有利实施例，以l: 2的占空比产生时钟乐jO中序列，并且 在每个连续的时间间隔内，控制一对光源，从而使一对光源中的一个光源被时 钟脉冲序列控制，而另一个光源^皮移动了一个脉冲周期并因此与原始的时钟J^ 沖序列反向的时钟l^中序列控制。这才科故的优势在于多个贿的样品及^4皮 分配的光源不是单独和^A净狄理，而是^j"iik^理，从而使#^析所需的 时间另外被减半。才Nt本专利技术的一个有利实施例，来自于每个样品的发射ife^皮转换为电才勤以 信号，其M过时钟乐辦预先确定的时间点处^iH样，并JUM^ii^^e^^/数字转换。在间隔内^l集并被数字化的所有采才^i被相加，并JUM^i^的平均值作为光强度的度量而被输出。通过tof带逸故大器的才勤A渝出信号的一个采才權并非^的输出信号进4封對^/数字转换，相应于A/D转换器的动态 棒l"生及其噪声不灵敏度而言，对A/D转换H^"很低的要求，从而可以使用更 ^i^并且更緩慢的A/D转换器。使仅具有相同频率辆目同相位的采才自目加仅 需^^艮小的石更^N^力，并且如果与，的"^f^r法(例:W目关或频率^^斤方法) 相比，还节省了计算时间。才M居本专利技术的一种有利实施例，在每个时钟l^中的脉冲周期中心附i^ii行 才對以信号的采样，优^^i^中周期中心朝向脉沖周期的^偏移处进行采样。 这#1故优点在于^f勤以信号的信号范围内进行采样，其中，才勤以信号已经达 到其调谐状态，并因j^中制了通过将发射it^换为电信号而产生的才勤以信号的调"^ii程，尤其是在使用了已知的光^U文大器阀或复用器并在下游iM有电^y电压转换器和带iti文大器的情况下尤为如此。才娥本专利技术的一种有利实施例，才勤以信"!^皮高通滤波、电^y电压转换以及净^带P艮制^i丈大。这才B故的优点在于尤其是4 干扰(如石m声、电#电感干扰、电源干扰等)以及j顿噪声被消除，并且仅^A位于带通通带内的 才對以信号对测量有贡献。采用高通滤波敏了由^M干扰引起的电i^电压转换用于实;^娥本专利技术的方法的有利设4^似'J^求10的M。 才娥本专利技术的设备的适当实施例^i殳计是似'J^求11-17的M。附图说明参照附图，通过实^4^专利技术的示例来说明本专利技术，附图如下 图1是用于定量实时分析荧光样品的设备方框图，图2 ^于控制根據图1的设备中的光源的一种变型的控制单元本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于定量实时分析荧光样品的方法，其中，所述样品被样品单用的光源（１２）激励而发荧光，并且测量荧光样品发出的光的强度，其特征在于：在所定义的间隔内，通过具有恒定脉冲频率的时钟脉冲序列使每个光源（１２）周期性地被开启和关闭，并且仅仅在所述光源（１２）的开启阶段测量所述样品的发射光的强度。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：N维特席夫，R特雷普托，GJ埃克特，A席尔，
申请(专利权)人：埃佩多夫股份公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]
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