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具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸制造技术

技术编号:5447846 阅读:155 留言:0更新日期:2012-04-11 18:40
本发明专利技术涉及具有乙酰木聚糖酯酶活性的分离的多肽和编码该多肽的分离的多核苷酸。本发明专利技术还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞以及产生和使用所述多肽的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及具有乙酰木聚糖酯酶活性的分离的多肽和编码该多肽的分离的多核 苷酸。本专利技术还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞,以及产生和使用所 述多肽的方法。相关技术描述植物细胞壁多糖构成植物细胞壁的90%并且能够分成以下三组纤维素、半纤维 素和果胶。纤维素是细胞壁多糖的主要成分。半纤维素是植物细胞壁中第二丰富的成分。 主要的半纤维素聚合物是木聚糖。植物细胞壁中发现的木聚糖的结构取决于它们的来源可 能差异显著,但是它们始终含有β-1,4-连接的D-木糖主链。β-1,4-连接的D-木糖主链 能够用多个侧基取代,所述侧基如L-阿拉伯糖(L-aribinose)、D-半乳糖、乙酰基、阿魏酰 基(feruloyl)、对-香豆酰基(p-coumaroyl)和葡糖醛酸残基。木聚糖主链的生物降解依赖于两类酶内切木聚糖酶和β-木糖苷酶。内切木聚 糖酶(EC 3. 2. 1. 8)将木聚糖主链切割成较小的寡糖,这些寡糖能够进一步通过β _木糖苷 酶(EC 3.2.1.37)降解成木糖。木聚糖的降解中涉及的其它酶包括,例如,乙酰木聚糖酯 酶、阿拉伯糖酶、α “葡糖醛酸糖苷酶、阿魏酸酯酶和对_香豆酸酯酶。乙酰木聚糖酯酶(EC 3. 1. 1. 6)从乙酰木聚糖的β -D-吡喃木糖基残基 (β-D-xylopyranosyl residue)上的2位和/或3位去除0_乙酰基。乙酰木聚糖在木 聚糖的水解中发挥重要作用,因为所述乙酰侧基能够在空间上干扰切割主链的酶的接近。 乙酰侧基的去除促进内切木聚糖酶的作用。基于序列相似性的糖酯酶分类体系产生了对 13个家族的定义,其中的七个含有乙酰木聚糖酯酶(Henrissat B.,1991,Biochem. J. 280 309-316,及 Henrissat 禾口 Bairoch,1996,Biochem. J. 316 695~696)。Margolles-Clark 等,1996,Eur. J. Biochem. 237 :553_560 公开了 来自里氏木霉 (Trichoderma reesei)的乙酷木聚糖酉旨醇。Sundberg 禾口 Poutanen,1991,Biotechnol. Appl. Biochem. 13 :1_11公开了里氏木霉的两种乙酰木聚糖酯酶的纯化和性质。WO 2005/001036公开了来自里氏木霉的乙酰木聚糖酯酶基因。美国专利5,681,732号公开了 来自黑曲霉(Aspergillus niger)的乙酰木聚糖酯酶基因。美国专利5,763,260号公开了 改变乙酰化木聚糖的性质的方法。本专利技术涉及具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸
技术实现思路
本专利技术涉及选自下组的具有乙酰木聚糖酯酶活性的分离的多肽(a)多肽,其包含与SEQ ID NO 2的成熟多肽具有至少85%同一性的氨基酸序列;(b)由如下多核苷酸编码的多肽,所述多核苷酸在至少高严紧条件下与以下杂交(i)SEQID NO 1的成熟多肽编码序列,(ii)包含SEQ ID NO 1的成熟多肽编码序列的基 因组DNA序列,或(iii)⑴或(ii)的全长互补链;(c)由如下多核苷酸编码的多肽,所述多核苷酸包含与SEQ ID NO :1的成熟多肽 编码序列具有至少85%同一性的核苷酸序列;和(d)变体,其包含取代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸的SEQID NO 2的成熟多肽。本专利技术还涉及选自下组的分离的多核苷酸,其编码具有乙酰木聚糖酯酶活性的多 肽(a)多核苷酸,其编码包含与SEQ ID NO 2的成熟多肽具有至少85%同一性的氨 基酸序列的多肽;(b)多核苷酸,其在至少高严紧条件下与以下杂交(i)SEQ ID NO :1的成熟多肽 编码序列,( )包含SEQ ID NO 1的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列,或(iii) (i)或(ii)的全长互补链;(c)多核苷酸,其包含与SEQ ID NO=I的成熟多肽编码序列具有至少85%同一性 的核苷酸序列;和(d)多核苷酸,其编码变体,该变体包含取代、缺失和/或插入一个或多个(几个) 氨基酸的SEQ ID NO 2的成熟多肽。本专利技术还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、重组表达载体、重组宿主细胞,和 产生具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽的方法。本专利技术还涉及抑制细胞中多肽表达的方法,包括向所述细胞施用或在所述细胞中 表达双链RNA(dsRNA)分子,其中所述dsRNA包含本专利技术的多核苷酸的亚序列。本专利技术还涉 及这样的双链抑制性RNA(dsRNA)分子,其中任选地所述dsRNA是siRNA或miRNA分子。本专利技术还涉及用于降解包含乙酰化木聚糖的材料的方法。本专利技术还涉及包含分离的多核苷酸的植物,所述多核苷酸编码这样的具有乙酰木 聚糖酯酶活性的多肽。本专利技术还涉及产生这样的具有乙酰木聚糖酯酶(活性)的多肽的方法,包括(a) 在有益于产生所述多肽的条件下培养转基因植物或植物部分,所述转基因植物或植物部分 包含编码这样的具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽的多核苷酸;和(b)回收所述多肽。本专利技术还涉及包含编码蛋白质的基因的核酸构建体,其中所述基因与编码信号肽 的核苷酸序列可操作地连接,所述信号肽包含SEQ ID NO :2的氨基酸1-16或由SEQ ID NO 2的氨基酸1-16组成,其中所述基因对于所述核苷酸序列是外源的。附图简述附图说明图1显示土生梭孢霉(Thielavia terrestris) NRRL 8126乙酰木聚糖酯酶的cDNA 序列和推导的氨基酸序列(分别为SEQ ID NOs :1和2)。图2显示pTerAxe2A的限制图谱。图3显示pAlLo39的限制图谱。定义乙酰木聚糖酯酶活性术语“乙酰木聚糖酯酶活性”在本文中定义为羧酸酯酶活性 (EC 3. 1. 1. 72),其催化乙酰基从聚合木聚糖、乙酰化木糖、乙酰化葡萄糖、α -乙酸萘酯、乙 酸对硝基苯酯(p-nitrophenyl acetate)的水解。就本专利技术而言,乙酰木聚糖酯酶活性是 按照实施例8中描述的步骤测定的。一个单位的乙酰木聚糖酯酶活性定义为能够在pH 5, 25°C每分钟释放1微摩尔对硝基苯酚阴离子(p-nitrophenolate anion)的酶量。本专利技术的多肽具有SEQ ID NO 2的成熟多肽的乙酰木聚糖酯酶活性的至少20%, 优选至少40 %,更优选至少50 %,更优选至少60 %,更优选至少70 %,更优选至少80 %,甚 至更优选至少90 %,最优选至少95 %,并且甚至最优选至少100 %。家族2或家族CE2或CE2 术语“家族2”或“家族CE2”或“CE2”在本文中定义为按 M Coutinho,P. M.禾口 Henrissat,B· (1999)Carbohydrate-active enzymes :an integrated database approach.于 RecentAdvances in Carbohydrate Bioengineering , H. J. Gilbert, G. Davies, B. Henrissat 禾口 B. Svensson 编,The Royal Society of Chem本文档来自技高网
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【技术保护点】
具有乙酰木聚糖酯酶活性的分离的多肽,其选自下组:(a)多肽,其包含与SEQIDNO:2的成熟多肽具有优选至少80%,更优选至少85%,甚至更优选至少90%,并且最优选至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的氨基酸序列;(b)由如下多核苷酸编码的多肽,所述多核苷酸在优选至少高严紧条件下与以下杂交:(i)SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列,(ii)包含SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列,或(iii)(i)或(ii)的全长互补链;(c)由如下多核苷酸编码的多肽,所述多核苷酸包含与SEQIDNO:1的成熟多肽编码序列具有优选至少85%,更优选至少90%,并且最优选至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%同一性的核苷酸序列;和(d)变体,其包含取代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸的SEQIDNO:2的成熟多肽。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2007-9-28 60/976,152具有乙酰木聚糖酯酶活性的分离的多肽,其选自下组(a)多肽,其包含与SEQ ID NO2的成熟多肽具有优选至少80%,更优选至少85%,甚至更优选至少90%,并且最优选至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%同一性的氨基酸序列;(b)由如下多核苷酸编码的多肽,所述多核苷酸在优选至少高严紧条件下与以下杂交(i)SEQ ID NO1的成熟多肽编码序列,(ii)包含SEQ ID NO1的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列,或(iii)(i)或(ii)的全长互补链;(c)由如下多核苷酸编码的多肽,所述多核苷酸包含与SEQ ID NO1的成熟多肽编码序列具有优选至少85%,更优选至少90%,并且最优选至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%同一性的核苷酸序列;和(d)变体,其包含取代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸的SEQID NO2的成熟多肽。2.权利要求1的多肽,其包含或其组成为SEQID NO 2的氨基酸序列;或其具有乙酰 木聚糖酯酶活性的片段。3.权利要求1的多肽,其由如下多核苷酸编码,所述多核苷酸包含或其组成为SEQID NO 1的核苷酸序列或其编码具有乙酰木聚糖酯酶活性的片段的亚序列。4.权利要求1的多肽,其由大肠杆菌NRRLB-50067中所含质粒pTterAXe2A中含有的 多核苷酸编码。5.分离的多核苷酸,其包含编码权利要求1-4中任一项的多肽的核苷酸序列。6.核酸构建体,其包含权利要求5的多核苷酸,该多核苷酸与指导所述多肽在表达宿 主中产生的一个或多个调控序列可操作地连接。7.重组宿主细胞,其包含权利要求6的核酸构建体。8.产生权利要求1-4中任一项的多肽的方法,包括(a)在有益于产生所述多肽的条件 下培养细胞,所述细胞以其野生型形式产生所述多肽;和(...

【专利技术属性】
技术研发人员:艾尔弗雷多洛佩斯德利昂丁晗澍
申请(专利权)人:诺维信公司
类型:发明
国别省市:DK

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