具有纤维二糖水解酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸制造技术

本发明专利技术涉及具有纤维二糖水解酶活性的分离的多肽和编码所述多肽的分离的多核苷酸。本发明专利技术还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞以及产生和使用所述多肽的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及具有纤维二糖水解酶活性的分离的多肽和编码该多肽的分离的多核 苷酸。本专利技术还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及产生和使用所 述多肽的方法。相关技术描述纤维素是一种通过β -1，4_键共价结合的简单糖类葡萄糖的聚合物。许多微生物 产生水解β-连接的葡聚糖的酶。这些酶包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖 苷酶。内切葡聚糖酶在随机位置消化纤维素聚合物，使其对纤维二糖水解酶的攻击敞开。 纤维二糖水解酶从纤维素聚合物的末端顺序释放纤维二糖分子。纤维二糖是水溶性β-1， 4-连接的葡萄糖二聚体。β -葡糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖。将纤维素原料转化成乙醇具有以下优势大量原料现成可用，避免焚烧或填埋材 料的合意性，和乙醇燃料的清洁性。木材、农业残余物、草本作物和城市固体废物被认为是 用于乙醇产生的原料。这些材料主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。一旦将纤维素转 化成葡萄糖，葡萄糖将容易地由酵母发酵成乙醇。WO 2004/056981 公开了来自嗜热毛壳(Chaetomium thermophilum)和嗜热毁丝 霉(Myceliophthora thermophila)的纤维二糖水解酶。Gusakov 等，2007，Biotechnology Bioengineering 97 :1028_1038 描述了分离自 Chrysosporiumlucknowense 的纤维二糖水解酶。本专利技术涉及具有纤维二糖水解酶活性的多肽和编码所述多肽的多核苷酸。
技术实现思路
本专利技术涉及选自下组的具有纤维二糖水解酶活性的分离的多肽(a)多肽，其包含与SEQ ID NO 2的成熟多肽具有至少80%同一性的氨基酸序列；(b)由如下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在至少高严紧条件下与以下杂交 (i)SEQ ID NO :1的成熟多肽编码序列，(ii)SEQ ID NO 1的成熟多肽编码序列中所含的 cDNA序列，或(iii)⑴或( )的全长互补链；(c)由如下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO :1的成熟多肽 编码序列具有至少80%同一性的核苷酸序列；和(d)变体，其包含取代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸的SEQID NO 2的成熟多肽。本专利技术还涉及选自下组的分离的多核苷酸，其编码具有纤维二糖水解酶活性的多 肽(a)多核苷酸，其编码包含与SEQ ID NO 2的成熟多肽具有至少80%同一性的氨 基酸序列的多肽；(b)多核苷酸，其在至少高严紧条件下与以下杂交(i)SEQ ID N0:1的成熟多肽 编码序列，(ii)SEQ ID NO 1的成熟多肽编码序列中所含的cDNA序列，或(iii)⑴或( ) 的全长互补链；(c)多核苷酸，其包含与SEQ ID NO=I的成熟多肽编码序列具有至少80%同一性 的核苷酸序列；和(d)多核苷酸，其编码变体，该变体包含取代、缺失和/或插入一个或多个(几 个) 氨基酸的SEQ ID NO 2的成熟多肽。本专利技术还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、重组表达载体、重组宿主细胞，和 产生具有纤维二糖水解酶活性的多肽的方法。本专利技术还涉及抑制多肽在细胞中表达的方法，包括向所述细胞施用或在所述细胞 中表达双链RNA(dsRNA)分子，其中所述dsRNA包含本专利技术的多核苷酸的亚序列。本专利技术还 涉及这样的双链抑制性RNA (dsRNA)分子，其中任选地所述dsRNA是siRNA或miRNA分子。本专利技术还涉及在洗涤剂和在将纤维素转化成葡萄糖和多种物质的转化中使用所 述具有纤维二糖水解酶(活性)的多肽。本专利技术还涉及包含分离的多核苷酸的植物，所述多核苷酸编码这样的具有纤维二 糖水解酶活性的多肽。本专利技术还涉及产生这样的具有纤维二糖水解酶(活性)的多肽的方法，包括(a) 在有益于产生所述多肽的条件下培养转基因植物或植物部分，所述转基因植物或植物部分 包含编码这样的具有纤维二糖水解酶活性的多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。本专利技术还涉及包含编码蛋白质的基因的核酸构建体，其中所述基因与编码信号肽 的核苷酸序列可操作地连接，所述信号肽包含SEQ ID NO :2的氨基酸1-17或由SEQ ID NO 2的氨基酸1-17组成，其中所述基因对于所述核苷酸序列是外源的。附图简述图IA和IB显示嗜热毁丝霉CBS 202. 75纤维二糖水解酶的基因组DNA序列和推 导的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO 1和2)。图2显示pSMail80的限制图谱。图3显示pSMail82的限制图谱。定义纤维二糖水解酶活性术语“纤维二糖水解酶活性”在本文中定义为1，4-D_葡聚 糖纤维二糖水解酶(E. C. 3. 2. 1. 91)活性，其催化纤维素、纤维四糖(cellotetriose)或任 何含有β_1，4-连接的葡萄糖的聚合物中l，4-i3-D-糖苷键的水解，从链的还原端或非还 原端释放纤维二糖。就本专利技术而言，根据由Lever等，1972, Anal. Biochem. 47 =273-279 ；van Tilbeurgh 等，1982，FEBS Letters,149 152-156 ；van Tilbeurgh 禾口 Claeyssens，1985， FEBS Letters, 187 :283_288 ；和 Tomme 等，1988，Eur. J. Biochem. 170 :575_581 描述的方 法测定纤维二糖水解酶活性。在本专利技术中，可以采用Lever等的方法评定玉米秸秆(cornstover)中纤维素的水解，而van Tilbeurgh等和Tomme等的方法可以用于测定纤维二糖水 解酶对于荧光二糖衍生物的活性。内切葡聚糖酶活性术语内切葡聚糖酶活性”在本文中定义为内 切-1，4-(1，3 ;l，4)-i3-D-葡聚糖 4-葡聚糖水解酶(endo-l，4-(1，3 ； 1， 4) - β -D-glucan4-glucanohydrolase) (Ε. C. 3. 2. 1. 4)，其催化纤维素、纤维素衍生物(例 如羧甲基纤维素和羟乙基纤维素)、地衣淀粉(Iichenin)中的1，4-β-D-糖苷键、混合型 β_1，3葡聚糖如谷类β-D-葡聚糖或木葡聚糖中的β _1，4键和其它含有纤维素组分的植 物材料的内水解(endohydrolysis)。就本专利技术而言，内切葡聚糖酶活性是使用羧甲基纤维 素(CMC)水解根据 Ghose，1987，Pure and App 1. Chem. 59 :257_268 的方法测定的。β _葡糖苷酶活性术语“ β -葡糖苷酶活性”在 本文中定义为β -D-葡糖苷葡糖水 解酶(Ε. C. 3. 2. 1. 21)活性，其催化末端非还原性β -D-葡萄糖残基的水解并释放β -D-葡 萄糖。纤维二糖酶与葡糖苷酶同义。就本专利技术而言，葡糖苷酶活性是在25°C使用 ImM 4-硝基苯基-β -D-吡喃型葡糖苷作为底物在50mM柠檬酸钠pH 4. 8中测定的。将一 个单位的β-葡糖苷酶活性定义为在25°C、pH 4. 8每分钟产生1.0微摩尔的4-硝基酚。家族6或家族GH6或Cel6 术语“家族6”或“家族GH6”或“Cel6”在本文中 定义为根据本文档来自技高网...

【技术保护点】
具有纤维二糖水解酶活性的分离的多肽，选自下组：（ａ）多肽，其包含与ＳＥＱＩＤＮＯ：２的成熟多肽具有优选至少８０％，更优选至少８５％，甚至更优选至少９０％，并且最优选至少９５％、至少９６％、至少９７％、至少９８％或至少９９％同一性的氨基酸序列；（ｂ）由如下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在优选至少高严紧条件下与以下杂交：（ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１的成熟多肽编码序列，（ｉｉ）包含ＳＥＱＩＤＮＯ：１的成熟多肽编码序列的基因组ＤＮＡ序列，或（ｉｉｉ）（ｉ）或（ｉｉ）的全长互补链；（ｃ）由如下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸包含与ＳＥＱＩＤＮＯ：１的成熟多肽编码序列具有优选至少８０％，更优选至少８５％，甚至更优选至少９０％，并且最优选至少９５％，至少９６％，至少９７％，至少９８％，或至少９９％同一性的核苷酸序列；和（ｄ）变体，其包含取代、缺失和／或插入一个或多个（几个）氨基酸的ＳＥＱＩＤＮＯ：２的成熟多肽。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2007-9-28 60/976,207具有纤维二糖水解酶活性的分离的多肽，选自下组(a)多肽，其包含与SEQ ID NO2的成熟多肽具有优选至少80％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％，并且最优选至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列；(b)由如下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸在优选至少高严紧条件下与以下杂交(i)SEQ ID NO1的成熟多肽编码序列，(ii)包含SEQ ID NO1的成熟多肽编码序列的基因组DNA序列，或(iii)(i)或(ii)的全长互补链；(c)由如下多核苷酸编码的多肽，所述多核苷酸包含与SEQ ID NO1的成熟多肽编码序列具有优选至少80％，更优选至少85％，甚至更优选至少90％，并且最优选至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％同一性的核苷酸序列；和(d)变体，其包含取代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸的SEQ IDNO2的成熟多肽。2.权利要求1的多肽，其包含或其组成为SEQID NO 2的氨基酸序列；或其具有纤维 二糖水解酶活性的片段。3.权利要求1的多肽，其由如下多核苷酸编码，所述多核苷酸包含或其组成为SEQID NO 1的核苷酸序列；或其编码具有纤维二糖水解酶活性的片段的亚序列。4.权利要求1的多肽，其由大肠杆菌NRRLB-50059中所含质粒pSMail82中含有的多 核苷酸编码。5.分离的多核苷酸，其包含编码权利要求1-4中任一项的多肽的核苷酸序列。6.核酸构建体，其包含权利要求5的多核苷酸，该多核苷酸与指导所述多肽在表达宿 主中产生的一种或多种调控序列可操作地连接。7.重组宿主细胞，其包含权利要求6的核酸构建体。8.产生权利要求1-4中任一项的多肽的方法，包括(a)在用于产生所述多肽的条件下 培养细胞，所述细胞以其野生型形式产生所述多肽；和(b)回收所述多肽。9.产生权利要求1-4中任一项的多肽的方法，包括(a)在有益于产生所述多肽的条件 下培养包含核酸构建体的宿主细胞，所述核酸构建体包含编码多肽的核苷酸序列；和(b) 回收所述多肽。10.产生亲本细胞的突变体的...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏钦德拉梅尤兰，保罗哈里斯，丁晗澍，金伯利布朗，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：发明
国别省市：DK[丹麦]