无饲养细胞培养基和系统技术方案

本发明专利技术提供细胞培养基和系统，其消除或至少降低对饲养细胞的需求。所述细胞培养基包含通常由饲养细胞分泌和／或产生的一或多种因子和包含ＩＧＦ－Ｉ和一部分玻连蛋白的合成嵌合蛋白。所述细胞培养基特别适合用于增殖人胚胎干细胞和角化细胞。本发明专利技术还涉及利用培养于本发明专利技术的细胞培养基中的细胞的组合物和方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及细胞培养。更具体地，本专利技术涉及用于饲养细胞非依赖型细胞培养系 统的培养基、系统和方法。
技术介绍
人胚胎干(hES)细胞来源于胚囊(4-5天大的早期胚胎)的内层细胞团(ICM)。hES 细胞是多能细胞类型，其能够产生三种主要的胚层，即外胚层、内胚层和中胚层[1，2]。换言 之，当给予必要的分化刺激时，这些细胞可发育成成人体内的超过200种细胞类型。或者， 当不给予分化刺激时，这些细胞将自我更新，产生多能子代细胞。有鉴于此，认为可以操纵hES细胞的多能行为以便更加有效地产生用于治疗适应 症的细胞和组织例如用于治疗帕金森氏病[3]、糖尿病[4]或脊髓损伤[5]。不过，这些潜 在用途并不仅仅限于产生用于移植的组织。最近，已经操纵hES细胞形成特定组织类型以 便测试新的药物和化合物[6]。可尽管有这些进展，在建立安全的培养方法之前，hES细胞 仍不具有治疗活性。1998年首次成功实现对hES细胞的衍生化[1]。Thomson等(1998)发现，采用有 丝分裂灭活型饲养层和胎牛血清(FBS)可成功繁殖hES细胞。不过，使用异基因产物，例如 人或动物血清和小鼠成纤维细胞，可能会在培养系统中引入污染产物，例如牛绵状脑病[7，8]。后来，还证明加入这些动物成分可引入免疫原性物(例如，N-羟乙酰神经氨酸，Neu5Ac) (Martin等2005 ；Heiskanen等2007)，提示生长于这些条件下，细胞的表型会受到微环境的 调控。显然，需要建立改进的hES细胞培养方法，同时又能为hES细胞的体外扩增提供必要 的条件。有鉴于此，许多研究者在研究使用人饲养细胞，包括人包皮成纤维细胞[9，10]和 成人骨髓细胞[11]。已经证明这两种细胞均支持hES细胞生长，由此可消除动物衍生的饲 养细胞造成污染的危险。不过，研究发现，经长期增殖后会出现分化率升高和异常核型[12，9]。例如，经细胞遗传学分析，一些hES细胞出现非整倍型[12]，包括获得染色体17q[13] 和20三体[14]。为解决这一问题，许多研究者一直尝试建立完全每不含动物产物的hES细胞培养 条件。具体而言，Xu等(2005)鉴定到碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)信号对于hES细胞 自我更新是至关重要的[15]，而其他研究者则推测调变转化生长因子(TGF)-i3信号途径 对于防止默认分化是必需的[16]。后来，Ludwig等(2006)使用复杂蛋白质混合物和大量 的纯化人血清白蛋白成功实现对hES细胞的物饲养细胞培养[17]。不过，这一研究发现，当 hES细胞培养数月后出现了 47XXY核型。尽管这已经取得了显著的进步，但hES细胞的成功 增殖显然仍需要饲养细胞。有趣的是，Xu等(2001)证实，来自小鼠胚胎成纤维细胞(MEF) 的条件培养基(CM)可支持hES细胞生长达130代倍增，而仍保持细胞的正常核型[18]。另一种需要依赖小鼠成纤维细胞饲养细胞才能存活并扩增的细胞类型是原代人 角化细胞。实际上，用于增殖hES细胞的许多培养技术，即血清和饲养细胞，均与角化细胞培养类似。已经证实，原代角化细胞需要依赖小鼠成纤维细胞饲养细胞才能进行体外非分 化扩增(Dawson 等 2006)。目前还不了解MEF对hES细胞培养物具有何种功能。不过已经证实这些饲养细胞 提供了多种对hES细胞以及角化细胞维持非分化状态而言至关重要的蛋白质。
技术实现思路
现有细胞培养系统依赖于无有丝分裂活性的饲养细胞层为细胞生长和/或增殖 提供生长和条件因子，这些细胞培养系统在治疗用途中具有严重的潜在缺陷。更具体地，使 用异基因产物可引入污染和感染因子，例如BSE和HIV。因此，本专利技术人认为需要一种新的改进的细胞培养系统，其能够消除或至少降低 对饲养细胞的需求。不仅如此，本专利技术人出乎预料地发现，包含IGF-I氨基酸序列和成熟玻 连蛋白的第1至64位氨基酸残基的合成嵌合蛋白在细胞培养基这展现出更高的活性，且特 别是能够刺激细胞迁移和/或增殖达到高水平。宽泛而言，本专利技术涉及用于取代或替代饲养细胞的无血清非条件细胞培养基，其 包含一或多种分离的饲养细胞替代因子。预期所述一或多种分离的饲养细胞替代因子可以 是任何蛋白质或其生物学活性片段，其通常由饲养细胞分泌和/或产生，以促进饲养细胞 依赖型细胞的生长。在第一个方面，本专利技术提供细胞培养基，其包含(i)合成嵌合蛋白，其包含胰岛素样生长因子(IGF)氨基酸序列和玻连蛋白(VN) 氨基酸序列；(ii)选自以下一组中的一或多种分离的饲养细胞替代因子人生长激素(hGH)、 骨形态发生蛋白15ΦΜΡ-15)、生长分化因子9(GDF-9)、巨核细胞集落刺激因子、分泌型卷 曲相关蛋白2、Wnt-2b、Wnt-12、生长抑制因子、胎球蛋白、人血清白蛋白(HSA)、肝细胞生 长因子(HGF)、转化生长因子-α (TGF-α)、转化生长因子-β (TGF-β )、神经生长因子、 血小板衍生的生长因子-β (PDGF-β)，PC-衍生的生长因子(progranulin)、白细胞介素 (IL)-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-13 和激活素-A(Activin-A)；和(iii)不含血清或含有明显减少量的血清，所述明显减少量的血清在缺乏IGF时 不能支持细胞的生长。优选地，所述一或多种分离的饲养细胞替代因子选自以下一组hGH、BMP-15、 ⑶P-9、巨核细胞集落刺激因子、分泌型卷曲相关蛋白2、Wnt-2b、Wnt-12、生长抑制因子和激 活素-A。甚至更优选地，所述一或多种分离的饲养细胞替代因子是激活素-A。在优选的实施方式中，所述细胞培养基还包含选自以下一组的一或多种额外的生 物学活性蛋白碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)、IGF-I、IGF-II和层 粘连蛋白。在更优选的实施方式中，所述一或多种额外的生物学活性蛋白选自bFGF和层粘 连蛋白。优选地，所述IGF氨基酸序列是IGF-I氨基酸序列或IGF-II氨基酸序列。更优选地，所述IGF氨基酸序列是IGF-I氨基酸序列。在优选的实施方式中，所述VN氨基酸序列是成熟玻连蛋白的第1至64位氨基酸残基。优选地，所述合成嵌合蛋白还包含接头序列，所述接头序列为一或多个甘氨酸残 基，且在特别优选的实施方式中，所述接头序列还包含一或多个丝氨酸残基。更优选地，所述接头序列为(Gly4Ser)4t5在另一优选的实施方式中，所述细胞培养基还包含分离的含IGF的复合物，其中 IGF 选自 IGF-I 禾口 IGF-II。在另一优选的实施方式中，其中所述分离的含IGF的复合物包含IGF-I，所述细胞 培养基还包含胰岛素样生长因子结合蛋白(IGFBP)和VN。在另一优选的实施方式中，其中所述存在于所述分离的含IGF的复合物中的IGF 是IGF-II，所述细胞培养基还包含VN。优选地，所述或每一饲养细胞替代因子的终浓度在大约0. lng/ml和50 μ g/ml之 间。更优选地，所述或每一饲养细胞替代因子的终浓度在大约5ng/ml和1500ng/ml之 间。甚至更优选地，所述或每一饲养细胞替代因子的终浓度在大约25ng/ml和 1000ng/ml 之间。进一步更优选地，所述或本文档来自技高网...

【技术保护点】
细胞培养基，其包含：（ｉ）合成嵌合蛋白，其包含胰岛素样生长因子（ＩＧＦ）氨基酸序列和玻连蛋白（ＶＮ）氨基酸序列；（ｉｉ）选自以下一组中的一或多种分离的饲养细胞替代因子：人生长激素（ｈＧＨ）、骨形态发生蛋白１５（ＢＭＰ－１５）、生长分化因子９（ＧＤＦ－９）、巨核细胞集落刺激因子、分泌型卷曲相关蛋白２、Ｗｎｔ－２ｂ、Ｗｎｔ－１２、生长抑制因子、胎球蛋白、人血清白蛋白（ＨＳＡ）、肝细胞生长因子（ＨＧＦ）、转化生长因子－α（ＴＧＦ－α）、ＴＧＦ－β、神经生长因子、血小板衍生的生长因子－β（ＰＤＧＦ－β）、ＰＣ－衍生的生长因子（ｐｒｏｇｒａｎｕｌｉｎ）、白细胞介素（ＩＬ）－１、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３和激活素－Ａ；和（ｉｉｉ）不含血清或含有明显减少量的血清，所述明显减少量的血清在缺乏ＩＧＦ时不能支持细胞的生长。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】AU 2007-9-4 2007904793;AU 2008-2-27 2008900955细胞培养基，其包含(i)合成嵌合蛋白，其包含胰岛素样生长因子(IGF)氨基酸序列和玻连蛋白(VN)氨基酸序列；(ii)选自以下一组中的一或多种分离的饲养细胞替代因子人生长激素(hGH)、骨形态发生蛋白15(BMP 15)、生长分化因子9(GDF 9)、巨核细胞集落刺激因子、分泌型卷曲相关蛋白2、Wnt 2b、Wnt 12、生长抑制因子、胎球蛋白、人血清白蛋白(HSA)、肝细胞生长因子(HGF)、转化生长因子 α(TGF α)、TGF β、神经生长因子、血小板衍生的生长因子 β(PDGF β)、PC 衍生的生长因子(progranulin)、白细胞介素(IL) 1、IL 2、IL 4、IL 6、IL 8、IL 10、IL 13和激活素 A；和(iii)不含血清或含有明显减少量的血清，所述明显减少量的血清在缺乏IGF时不能支持细胞的生长。2.权利要求1的细胞培养基，其中所述一或多种分离的饲养细胞替代因子选自以下一 组hGH、BMP-15,⑶P-9、巨核细胞集落刺激因子、分泌型卷曲相关蛋白2、Wnt_2b、Wnt_12、 生长抑制因子和激活素-A。3.前述权利要求中任一项的细胞培养基，其中所述一或多种分离的饲养细胞替代因子 是激活素-A。4.前述权利要求中任一项的细胞培养基，其中所述细胞培养基还包含选自以下一组的 一或多种额外的生物学活性蛋白碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)、 IGF-I、IGF-II和层粘连蛋白。5.前述权利要求中任一项的细胞培养基，其中所述一或多种额外的生物学活性蛋白选 自bFGF和层粘连蛋白。6.前述权利要求中任一项的细胞培养基，其中所述IGF氨基酸序列是IGF-I氨基酸序 列或IGF-II氨基酸序列。7.前述权利要求中任一项的细胞培养基，其中所述IGF氨基酸序列是IGF-I氨基酸序列。8.前述权利要求中任一项的细胞培养基，其中所述VN氨基酸序列是成熟VN的1至64位氨基酸残基。9.前述权利要求中任一项的细胞培养基，其中所述合成嵌合蛋白还包含一或多个甘氨 酸残基和一或多个丝氨酸残基的接头序列。10.前述权利要求中任一项的细胞培养基，其中所述接头序列为(Gly4Ser)4t511.前述权利要求中任一项的细胞培养基，其还包含分离的含IGF的复合物，其中IGF 选自 IGF-I 和 IGF-II。12.前述权利要求中任一项的细胞培养基，当IGF-II存在于所述分离的含IGF的复合 物中时，所述培养基还包含VN。13.前述权利要求中任一项的细胞培养基，当IGF-I存在于所述分离的含IGF的复合物 中时，所述培养基还包含IGFBP和VN。14.前述权利要求中任一项的细胞培养基，其中所述IGFBP选自以下一组IGFBP-1、 IGFBP-2、IGFBP-3、IGFBP-4、IGFBP-...

【专利技术属性】
技术研发人员：Z厄普顿，D利弗斯利，SD理查兹，LB科马克，D哈金，
申请(专利权)人：昆士兰技术大学，
类型：发明
国别省市：AU[澳大利亚]