重组蛋白的重折叠制造技术

提供了用于回收和纯化异源宿主细胞中所生成的重折叠的重组蛋白的方法，该方法包括在高ｐＨ缓冲液中重折叠所述蛋白质的步骤。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关申请本申请要求2006年7月14日提交的美国临时申请流水号60/830,831的优先权及权益，在此完整收录其说明书。专利
本专利技术涉及用于获得在细胞培养物中生成的异源重组蛋白的方法。本专利技术包括用于回收和纯化重折叠的重组蛋白的方法，所述重组蛋白已经在原核宿主细胞中生成并存在于这些细胞中，典型地存在于周质空间或胞内空间中。所述在原核宿主细胞中生成的重组蛋白还可以作为可溶性蛋白质或者作为可溶性蛋白质和不溶性蛋白质的混合物被发现。
技术介绍
许多治疗上有关的重组蛋白是在多种宿主生物体中生产的。大多数蛋白质可以在真核宿主(诸如CHO细胞)中以它们的天然形式表达。动物细胞培养一般要求延长生长时间以达到最大的细胞密度并最终获得比原核细胞培养低的细胞密度(Cleland，J.(1993)ACS Symposium Series526，ProteinFoldingIn Vivo and In Vitro，American Chemical Society)。另外，动物细胞培养常常要求昂贵的培养基，其含有可能干扰所需蛋白质回收的培养组分(growth components)。细菌宿主表达系统为生产规模的重组蛋白生产提供了有成本效益的替代方案。有许多关于重组蛋白的常规细菌表达的美国专利，包括美国专利第4,565,785号；第4,673,641号；第4,795,706号；及第4,710,473号。该生产方法的一个主要优点是通过离心或微滤容易地从细胞组分中分离产物的能力。参见例如Kipriyanov和Little，(1999)Molecular Biotechnology，12173-201；及Skerra和Pluckthun，(1988)Science，2401038-1040。 然而，细菌表达系统(诸如大肠杆菌)缺乏促进蛋白质正确重折叠的细胞机器，而且一般不导致大蛋白质分泌进入培养基。在细菌宿主细胞中表达的重组蛋白常常被发现是包涵体，其由部分折叠的和错误折叠的还原的蛋白质的密实块组成。参见例如Baneyx，(1999)Current Opin.Biotechnology10411-421；及Villaverde和Carrio，(2003)Biotech.Letts.251385-1395。蛋白质也可以在不形成包涵体的情况中表达。参见例如同前。典型地在包涵体中，重组蛋白一般是无活性的。 另外，重折叠常常产生错误折叠的和二硫化物连接的二聚体、三聚体、和多聚体(Morris等，(1990)Biochem.J.，268803-806；Toren等，(1988)Anal.Biochem.，169287-299)。这种缔合现象在蛋白质重折叠过程中是非常普通的，特别是在较高的蛋白质浓度，而且常常表现为牵涉经由部分折叠的中间体的疏水相互作用的缔合(Cleland和Wang，(1990)Biochemistry，2911072-11078)。 错误折叠发生于发酵过程或分离规程过程中的细胞中。从周质空间或胞内空间回收的蛋白质必须溶解，而且可溶性蛋白质必须重折叠成天然状态。参见例如Rudolph，Renaturation of Recombinant，Disulfide-Bonded ProteinsFrom“Inclusion Bodies”于Modern Methods in Protein-and Nucleic AcidResearch(Walter de Gruyter New York，1990)pp.149-172。用于重折叠蛋白质成为正确的、有生物学活性的构象的体外方法对于获得功能性蛋白质是至关重要的。自包涵体回收的蛋白质的典型下游加工包括在高浓度的变性剂(诸如尿素)溶解包涵体，接着稀释变性剂以允许发生重折叠(参见美国专利第4,512,922号；第4,511,502号；及第4,511,503号)。还可参见例如Rudolph和Lilie，(1996)FASEBJ.，1049-56；Fischer等，(1993)Biotechnology andBioengineering，413-13；Misawa和Kumagai，(1999)Biopolymers51297-307；Clark，(1998)Current Opinion in Biotechnology，9157-163；及Tsumoto等，(2003)Protein Expression and Purification281-8。此类回收方法被认为是在略微改变后普遍适用于从包涵体中回收有生物学活性的重组蛋白。这些方法已经应用于肝素结合蛋白(HBP)，诸如VEGF(Siemeister等(1996)同上)。这些方法试图消除随机二硫化物成键，之后通过它的其它稳定力使重组蛋白变成它的生物学活性构象，而且可以不消除不正确折叠的中间体，提供正确折叠产物的均质群，或提供足够量的正确折叠产物。 通过将单一蛋白质封装在胶团内或者在树脂上分离它们然后除去变性剂，反胶团(reversed micelle)或离子交换层析已经用于帮助变性蛋白质的重折叠(Hagen等，(1990)Biotechnol.Bioeng.，35966-975；Creighton(1985)于Protein Structure Folding and Design(Oxender，D.L.编)pp.249-251，New YorkAlan R.Liss，Inc.)。这些方法已经用于防止蛋白质聚集和促进正确重折叠。为了改变重折叠的速率或程度，已经用针对蛋白质天然结构的配体和抗体实施了构象特异性重折叠(Cleland和Wang，(1993)，于Biotechnology，(Rehm H.-J.和Reed G.编)pp.528-555，New York，VCH)。例如，肌酸激酶在存在针对其天然结构的抗体时重折叠(Morris等，(1987)Biochem.J.，24853-57)。在抗体之外，配体和辅因子已经用于增强重折叠。这些分子在天然蛋白形成之后更有可能与正在折叠中的蛋白质相互作用。因此，可以将折叠平衡向天然状态“驱动”。例如，血红素铁的轴向位置(axial position)的外在配体(extrinsic ligand)提高了亚铁细胞色素c的重折叠速率(Brems和Stellwagon，(1983)J.Biol.Chem.，2583655-3661)。侣伴蛋白和折叠催化剂也已经用于帮助蛋白质折叠。参见例如Baneyx，(1999)Current Opinion in Biotechnology，10411-421；及Carrio和Villaverde，(2003)FEBS Letters537215-221。然而，这些方法对于生产大量的蛋白质产物未必总是有效的或足够的。 需要从宿主细胞培养物中折叠和/或回收重组蛋白的新的和更有效的方法，例如用于在细菌细胞培养物中高效地和经济地生产重组蛋白。这些新的和更有效的方法提供了高度纯化的、有生物学活性的、正确重折叠的蛋白质的回收的改善，而且普遍适用于生产规模的蛋白质生产。本专利技术满足了这些需要和其它需要，在阅读以下公开内容后将是显而易见的。 专利技术概述 本本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于从原核细胞培养物中回收重折叠的重组蛋白的方法，该方法包括下列步骤：　（ａ）从所述原核细胞培养物中分离重组蛋白；　（ｂ）使所述蛋白质在第一缓冲溶液中溶解，所述第一缓冲溶液其ｐＨ大于９且包含第一离液剂；　（ｃ）使所述溶 解的蛋白质在第二缓冲溶液中重折叠，所述第二缓冲溶液其ｐＨ大于９但小于等于１１且包含第二离液剂、两种或更多种还原剂且通入空气或氧气，其时间和条件使得所述重组蛋白发生重折叠；并　（ｄ）回收所述重折叠的重组蛋白。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2006-7-14 60/830,8311.一种用于从原核细胞培养物中回收重折叠的重组蛋白的方法，该方法包括下列步骤(a)从所述原核细胞培养物中分离重组蛋白；(b)使所述蛋白质在第一缓冲溶液中溶解，所述第一缓冲溶液其pH大于9且包含第一离液剂；(c)使所述溶解的蛋白质在第二缓冲溶液中重折叠，所述第二缓冲溶液其pH大于9但小于等于11且包含第二离液剂、两种或更多种还原剂且通入空气或氧气，其时间和条件使得所述重组蛋白发生重折叠；并(d)回收所述重折叠的重组蛋白。2.权利要求1的方法，其中所述重组蛋白是生长因子。3.权利要求2的方法，其中所述生长因子是血管内皮生长因子(VEGF)。4.权利要求3的方法，其中所述VEGF是VEGF165。5.权利要求1的方法，其中所述第一和第二离液剂是尿素。6.权利要求1的方法，其中所述第一缓冲溶液还包含精氨酸。7.权利要求1的方法，其中所述第二缓冲溶液还包含精氨酸。8.权利要求1的方法，其中所述第一缓冲溶液包含终浓度1M尿素、300mM精氨酸、10mM CHES、5mM EDTA，pH 11。9.权利要求1的方法，其中所述第一缓冲溶液包含终浓度1M尿素、300mM精氨酸、10mM TRIS、5mM EDTA，pH 11。10.权利要求1的方法，其中所述第二缓冲溶液包含终浓度1M尿素、15mM半胱氨酸、2mM DTT、100mM精氨酸、10mM CHES、5mM EDTA，pH 10。11.权利要求1的方法，其中所述第二缓冲溶液包含终浓度1M尿素、15mM半胱氨酸、0.5-2mM DTT、100mM精氨酸、10mM TRIS、5mM EDTA，pH 10。12.权利要求1的方法，其中将所述重组蛋白在所述第一缓冲溶液中温育至少1小时。13.权利要求12的方法，其中所述温育是在2-40℃进行的。14.权利要求1的方法，其中将所述溶解的蛋白质在所述第二缓冲溶液中温育约3-24小时。15.权利要求14的方法，其中所述温育是在2-40℃进行的。16.权利要求1的方法，其中所述两种或更多种还原剂包含半胱氨酸和DTT。17.权利要求1的方法，其中所述通入空气或氧气是以akLa＝0.001-0.1min-1提供的。18.权利要求1的方法，还包括通过通入氮气来使所述重折叠的重组蛋白稳定。19.权利要求1的方法，其中所述回收步骤(d)包括使含有所述重组蛋白的所述第二缓冲溶液澄清，并使所述重折叠的重组蛋白相继接触混合式层析支持物、阳离子层析支持物...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢利皮扎罗，艾伦桑切斯，查尔斯H施梅尔泽，
申请(专利权)人：健泰科生物技术公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]