编码Ｎ－甲基腐胺氧化酶之核酸及其应用制造技术

本发明专利技术提供编码Ｎ－甲基腐胺氧化酶（ＭＰＯ）的基因及其核酸建构物，包括独自调控ＭＰＯ表达的方法，或与调控其它生物碱合成基因相结合调控ＭＰＯ表达以调节植物和宿主细胞中生物碱的生成。ＭＰＯ基因或其片段因而有助于减少或增加植物吡咯烷类生物碱或托烷类生物碱的生成和在宿主细胞内生产ＭＰＯ酶。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】编码N-甲基腐胺氧化酶之核酸及其应用临时专利申请之优先权本专利技术要求于2006年6月19日所申请美国临时专利申请，申请号为60/814,542及于2007年2月16日所申请美国临时专利申请，申请号为60/901,654之优先权。
本专利技术涉及植物，植物细胞或其它类细胞之分子生物学及生物碱合成。除与其它事项相关外，该专利技术还涉及编码N-甲基腐胺氧化酶(N-methylputrescineoxidase，MPO)的核酸序列以及应用该核酸序列改良植物中生产生物碱的方法，尤其是但不完全是应用该核酸序列在烟草植物中生产烟碱，及在植物细胞或其它类细胞中生产生物碱合成酶的方法。
技术介绍
吡咯烷类生物碱(例如烟碱)及托烷类生物碱(例如东茛菪碱和古柯碱)是具有多种不同药理活性的植物天然产物。例如，烟碱可以促进认知机能，并应用于戒烟治疗中的烟碱替代疗法。托烷类生物碱是重要的抗胆碱能类药物。古柯碱被用作局部麻醉药。这些化合物均从植物分离，并被作为药物使用。人们有兴趣通过遗传工程方式来增加植物和植物细胞中吡咯烷类生物碱及托烷类生物碱的生产，以便更有效地商业化生产这些化合物以用于药物制造业。增加上述两种生物碱的生产可以通过选择育种，或通过使用编码这些生物碱合成酶基因的遗传工程。累积代谢途径中间产物或减少生物碱终末产物的遗传工程方法包括经典或定向诱变，如定向诱导基因组局部突变技术(TargetingInducedLocalLesionsinGenomes，TILLING)，或利用RNA干扰及相关技术特异性沉默编码这些酶的基因。人们也有兴趣阻断上述生物碱合成途径中某些特定的代谢步骤，以累积本身可能具有高价值的代谢途径中间产物，或生产包括修饰过或含量减少的生物碱终末产物的植物。烟碱含量经遗传工程而减少的烟草植物可能有助于生产来自于植物的药物，烟碱含量低或无烟碱的香烟。所述香烟可以用于辅助戒烟(Benowitzetal.ClinPharmocolTher.80(6)：703-14(2006))，和用于生产低毒性工业产品，食品或生物量农作物。人们对编码吡咯烷类生物碱及托烷类生物碱的生物合成酶的基因知之甚少，这限制了通过遗传工程生成这些有效化合物代谢途径的能力。一个编码参与吡咯烷类生物碱合成酶的已知基因的例子是喹啉磷酸核糖转移酶(QPT)基因，所述的QPT基因从烟草和黄花烟草中克隆的。见美国专利6,423,520及专利6,586,661及Sinclairetal.，PlantMol.Biol.44：603-17(2000)。抑制QPT基因表达能显著降低转基因烟草植物中烟碱含量。Xieetal.，RecentAdvancesinTobaccoScience30：17-37(2004)。美国专利5,369,023及5,260,205讨论通过抑制腐胺甲基转换酶(PMT)核酸序列来降低烟碱含量。抑制内源性PMT核酸序列降低烟碱含量，并增加去氢新烟碱含量2至6倍。Hibietal.，PlantCell6：723-35(1994)；Satoetal.ProcNatlAcadSciUSA98：367-72(2001)；ChintapakornandHamill，PlantMol.Biol.53：87-105(2003)；Steppuhnetal.，PLoSBiol.2：8：e217：1074-1080(2004)。烟草PMT基因在美花烟草超表达可增加烟碱含量。(Satoetal.ProcNatlAcadSciUSA98：367-72(2001))。抑制内源性基因序列A622及NBB1可降低烟草植物中烟碱含量。见国际专利公开号WO2006/109197。已从烟草中克隆转换烟碱为去甲烟碱的细胞色素P450单氧化酶基因。SiminszkyB.，etal.，ProcNatlAcadSciUSA102：14919-24，(2005)；Gavilanoetal.J.Agric.FoodChem.54，9071-9078(2006)。MPO酶活性是三十年前在烟草植物根部最初检测到，MizusakiSetal.，Phytochemistry11：2757-2762(1972)，但MPO基因在本专利技术前并未得到确定。MPO在植物生物碱包括药用托烷类生物碱的合成途经中起作用。HashimotoandYamada，Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.45：257-285(1994)；Kutchan，In：Cordell，G.A.(ed.)ALKALOIDS(SanDiego)，vol.50.AcademicPress，Inc.，SanDiego，CA，USA，(1998)pp.257-316。已从烟草，黄花烟草，天仙子，及白曼陀罗与黄花曼陀罗杂种植物根部纯化MPO酶，与氧化腐胺和尸胺相比，该酶能更有效地氧化N-甲基腐胺。Mizusakietal.，Phytochemistry11：2757-2762(1972)；FethandWagner，Phytochemistry24：1653-1655(1985)；Daviesetal.，Phytochemistry28：1573-1578(1989)；Hashimotoetal.PlantPhysiol.93：216-221(1990)；WaltonandMcLauchlan，Phytochemistry29：1455-1457(1990)；HaslamandYoung，Phytochemistry31：4075-4079(1992)；McLauchlanetal.，Planta19：440-445(1993)；Boswelletal.，Phytochemistry52：871-878(1999)。消旋毒藜碱和新烟草灵[顺-2，4娣(3-吡啶基)哌啶]含有哌啶成分，消旋毒藜碱的哌啶成分被认为经由烟草中Δ-1-哌啶来自尸胺。WatsonandBrown，J.Chem.Soc.PerkinTrans.1：2607-2610(1990)。虽然其亲合性低于N-甲基化二氨，尸胺是二氨氧化酶的良性底物，亦是MPO的底物。Hashimotoetal.(1990)，supra；WaltonandMcLauchlan，Phytochemistry29：1455-1457(1990)；Boswelletal.，Phytochemistry52：871-878(1999)。在我们申请美国临时专利60/814，542之后，Katoh等在PlantCellPhysiol.48(3)：550-554(2007)及Heim等在Phytochemistry68：454-463(2007)披露了烟草中参与烟碱合成途经的MPO基因。但是，他们在文献中并未提及利用该基因在烟草植物中改变烟碱或其它生物碱含量的方法或用途。因此，有必要持续认定其它表达可以调节的基因，以减少或增加生物碱生物合成，或通过改变植物中某一特定生物碱的合成来改变该植物的生物碱生成图谱。
技术实现思路
一方面，本专利技术提供一种分离的核酸分子，其包括选自以下的核苷酸序列：(a)SEQIDNO：1表示的核苷酸序列；(b)SEQIDNO：2表示的核苷酸序列；(c)编码具有本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的核酸分子，其包括选自以下的核苷酸序列：　　ａ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１表示的核苷酸序列；　　ｂ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２表示的核苷酸序列；　　ｃ）编码具有ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３表示的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列；　　ｄ）与（ａ），（ｂ）或（ｃ）的核苷酸序列至少８５％相同，并编码ＭＰＯ酶的核苷酸序列；　　ｅ）与（ａ），（ｂ），（ｃ）或（ｄ）的核苷酸序列在严格条件下杂交，并编码ＭＰＯ酶的核苷酸序列；和　　ｆ）因遗传密码的简并性而与（ａ）或（ｂ）的核苷酸序列不同并编码ＭＰＯ酶的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2006-6-19 60/814,542;US 2007-2-16 60/901,6541.一种分离的核酸分子，其选自以下的核苷酸序列：a)SEQIDNO：1表示的核苷酸序列；b)SEQIDNO：2表示的核苷酸序列；c)编码SEQIDNO：3表示的氨基酸序列的核苷酸序列。2.一种生产N-甲基腐胺氧化酶的方法，其包括：a)使用包含权利要求1所述分离的核酸分子的核酸构建体遗传改造细胞和；b)在可以产生N-甲基腐胺氧化酶的条件下培养所述细胞。3.一种重组N-甲基腐胺氧化酶，其氨基酸序列为SEQIDNO：3。4.一种遗传工程宿主细胞，其包含权利要求1所述的核酸序列，其中所述的细胞是在体外培养的并且所述的细胞不具备发育成完整植株的能力。5.根据权利要求4所述的宿主细胞，其中所述细胞选自细菌、酵母、丝状真菌、藻类、植物细胞和哺乳动物细胞。6.如权利要求5所述的宿主细胞，其中，所述细胞为植物细胞。7.一种相对于对照植物在植物中下调N-甲基腐胺氧化酶的表达的方法，包括：a)在所述植物中引入核酸，所述核酸包括：(i)RNAi质粒或病毒诱导的基因沉默载体中的至少一种；以及(ii)选自以下的核苷酸序列：(1)SEQIDNO：1中的核苷酸754-1132；(2)SEQIDNO：1中的核苷酸1521-1772；(3)SEQIDNO：1中的核苷酸1129-1405；(4)SEQIDNO：1；和(5)SEQIDNO：2；和b)在与相似条件下培养的对照植物相比，所述核苷酸序列被转录的条件下培养所述植物，所述转录导致所述植物中N-甲基腐胺氧化酶水平的降低。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述植物属于菸草属。9.根据权利要求7所述的方法，其中所述植物是菸草。10.根据权利要求7所述的方法，其包括下调NBB1、A622、喹啉磷酸核糖转移酶和腐胺甲基转换酶中的至少一种。11.一种分离的宿主植物细胞，通过遗传工程化具有降低的N-甲基腐胺氧化酶水平，包括：a)RNAi质粒，所述RNAi质粒包括下列至少一种序列：(i)SEQIDNO：1中的核苷酸754-1132；(ii)SEQIDNO：1中的核苷酸1521-1772；(iii)SEQIDNO：1中的核苷酸1129-1405；(iv)SEQIDNO：1；或(v)SEQIDNO：2；或b)病毒诱导的基因沉默...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔纳森E佩奇，刘恩武，
申请(专利权)人：加拿大国家研究委员会，
类型：发明
国别省市：CA[]