本发明专利技术涉及使用单个的肽缀合纳米新月体表面增强拉曼散射（ＳＥＲＳ）探针以至少纳摩的灵敏度进行蛋白酶的体外检测。所述探针能够以极小的体积和低浓度下检测蛋白水解活性。在某些实施方式中，所述探针包括用于检测活性蛋白酶的指示物，其中所述指示物包括附接于肽的纳米新月体，其中所述肽包括蛋白酶的识别位点和附接于所述肽的拉曼标记。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及利用纳米探针检测蛋白酶的表面增强拉曼散射(SERS)领域。 具体来说，本专利技术涉及在前列腺癌的诊断应用中前列腺特异性抗原(PSA)和 有蛋白水解活性的PSA的检测。
技术介绍
前列腺癌是欧洲和北美的男性中最常见的癌症(Crawford (2003) t/ra/o^ 62:3-12; Gronberg等人92003 361:859-864; Pienta等人(2006) t/ra/ogy48:676-683)。前列腺癌的临床诊断方式之一是测量前列腺特异性抗原(PSA 或hK3)的血浆蛋白浓度，该抗原是通常从前列腺内腔上皮细胞分泌的大的 激肽释放酶(hK)蛋白酶家族中的一员(回顾参见，例如，Yousef和Diamandis (2001) i ev.， 22: 184-204; Denmeade和Isaacs (2002)淑T ev. C画er2:389-396; Denmeade和Isaacs (2004)5Jf7/" 93 Suppl 1:10-15)。与其它激肽 释放酶家族成员不同，PSA是类胰凝乳蛋白酶丝氨酸蛋白酶(Robert等人 (1997) Aoc/^m^o; 36:3811-3819)。在前列腺癌中，借助于蛋白水解活性， PSA与对抗细胞外基质的组织改造有关，对肺瘤入侵或发展的关键控制机制 有作用。其它蛋白酶也在癌症中具有相似的作用。始于二十世纪八十年代的血浆PSA篩查的引入已经极大地改善了前列腺癌的诊断、分期和处置(Denmeade和Isaacs (2002) Ato. Ca"cer2:389-396);然而，血浆PSA浓度的测量并没有将前列腺癌病人与良性前列腺增生病人区分开，导致高的错误阳性率，需要更昂贵的活检，并且甚至进行不必要的外科程序(Denmeade和Isaacs (2004) 93 Suppl 1:10-15;Robert等人(1997)历0c/2e附&^y 36:3811-3819)。提高PSA的临床价值以进行前列腺癌早期检测的努力包括对PSA的各种分子异构物的表征(Mikolajczyk等人 (2004) C7/". Ozem" 50:1017-1025; Mikolajczyk和Rittenhouse (2003) / Med 52:86-91; Mikolajczyk等人(2004) C7/".历oc/zem. 37:519-528)。在那些各种异构物当中，PSA的有蛋白水解活性的亚群被接受作为是比血清PSA浓度更有效的胂瘤标志物和恶性预测物(Wu等人(2004)尸mstote 58: 354-353; Wu等人(2004) C7/w. Oze肌，50:125-129)。通过常规的免疫染色方法对PS A存在的简单检测不能揭示PSA的蛋白水解活性；因此，开发新的方法以区分蛋白水解活性异构物是非常重要的。已经证实精液携带有大量的有蛋白水解活性的PSA并且是用于蛋白酶活性测定的PSA生物资源(Brillard隱Bourdet等人(2002) >/ A0c/2em., 269:390-395;Rehault等人(2002)所oc/h.附.Jcto 1596:55-62)。有蛋白水解活性的PSA在精液中的浓度为10-150|aM(Rehault等人(2002) S/oc/ >w.所0;7/7,爿cto 1596:55-62),而其在血浆中的浓度则低得多，从健康个体中小于O.lnM到有前列腺疾病的病人中高于lnM(Rittenhouse等人(1998) O". C7/w.丄W. 5W.， 35:275-368)。然而，测量精液中或来自细针抽吸的活组织检查样品中PSA的蛋白水解活性的测定仍没有被广泛接受，这是由于蛋白水解活性的快速衰减，以及从年老病人可获得的精液量或活组织检查样品的量有限。现有检测方法的灵敏度达到了 PSA蛋白质的亚纳摩浓度(Acevedo等人(2002) C7/". C/n'm.爿cto 317:55-63; Charrier等人(1999)五/ec ra/ /wm^ 20:1075-1081; Bjartell等人C""cw P D2: 140-147)(大部分通过抗体对PSA的结合亲和力确定)，并且需要相对大的样品体积(毫升)。然而，酶的化验并不享有相同的灵敏度增强。
技术实现思路
在某些实施方式中，本专利技术展示了使用单一的至少具有纳摩灵敏度的肽8结合纳米新月体表面增强拉曼散射(SERS)指示物(探针)的蛋白酶体外检测。该指示物能够以极小的体积检测蛋白水解活性。在某些实施方式中，检测体积小于约80飞升(femtoliter)，优选小于约50飞升，更优选小于约40或30飞升，且进一步更优选小于约20或15飞升。在某些实施方式中，使用高度聚焦的激发源允许检测体积仅为约10飞升。在各种实施方式中，纳摩样品的实际蛋白酶分子数小于约40个分子，优选小于约40个分子，更优选小于约30、 20、或10个，且在某些实施方式中接近于单分子水平。与其它癌生物标志物检测测定相比，本专利技术的生物结合的纳米新月体允许检测飞升体积中蛋白水解活性蛋白酶分子的纳摩浓度，特别是对于单一癌细胞水平的癌症筛查来说，这是关键的。小体积性能的主要优点和应用之一是其可用于在单一细胞水平下检测癌细胞的蛋白酶例如前列腺特异性抗原(PSA)的活性。小体积的要求和灵敏度水平能够在捕获的循环前列腺癌细胞中检测PSA活性用于指示转移，这对于常规技术来说是不可行的。在精液中，PSA浓度为10-150)LiM,其中约三分之二的PSA有酶活性。用纳米新月体PSA探针(纳摩范围)实现的灵敏度水平对基于精液的测定是足够的，因此，这里描述的纳米新月体SERS平台可用于临床应用。在某些实施方式中，底物是纳米新月体表面增强拉曼散射(SERS)探针。表面增强拉曼散射(SERS)探针由缀合到纳米新月体芯和壳的肽组成，其中该探针的特征在于连接到拉曼活性标记的可以由蛋白酶特异性剪切的序列(例如，蛋白酶识别位点)。因此，该肽缀合的纳米新月体可用作特定的筛查工具以提供生物性样品中 一种或多种蛋白酶的存在、浓度和蛋白水解活性的信息，所述蛋白酶包括但不限于各种癌症的生物标志物，例如前列腺特异性抗原(PSA)。在一个实施方式中，该纳米新月体包括芯和壳，具有缀合或粘连到该纳米新月体表面的肽。该肽包括被待检测的相应蛋白酶特异识别和剪切的底物。在某些实施方式中，对蛋白酶有特异性的其它肽底物可用于纳米探针。可能存在这样的情况，具有较好的动力学性质的底物肽可以用于加快检测过程。在一个实施方式中，对PSA具有较好特异性的其它肽也可用于更精确地检测PSA。9在各种实施方式中，不仅测量蛋白质的存在，实时反应监测还提供有关 蛋白酶活性的信息。不同的拉曼标记分子都可以使用并成功地用于实施例 中，从而证明了可以通过多重化肽缀合纳米新月体进行两种或更多种类型的 癌症相关(或其它)的蛋白酶的检测。在某些实施方式中，芯可包括磁性材料 以允许独立纳米颗粒的空间访问。在某些实施方式中，在特异性上彼此正交或有少量重叠的不同的肽底物 可以用于检测相应的蛋白酶。肽库可以缀合到纳米新月体探针并以随机阵列 或有序微阵列的形式在空间上分开。肽纳米新月体杂本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于检测活性蛋白酶的指示物，所述指示物包括： 附接于肽的纳米新月体，其中所述肽包括所述蛋白酶的识别位点。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈帆青，刘刚，卢克P李，乔纳森A埃尔曼，
申请(专利权)人：加利福尼亚大学董事会，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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