本发明专利技术提供了一种靶向环肽修饰的脂质体微泡及其制备方法。所述的靶向环肽修饰的脂质体微泡包括带有链酶亲和素的脂质体微泡，其特征在于，所述脂质体微泡通过链酶亲和素与生物素的亲和作用连接生物素－聚乙二醇－可与肝纤维化或肝硬化中新生血管内皮细胞表面上的受体相结合的靶向环肽。本发明专利技术还提供了上述靶向环肽修饰的脂质体微泡的制备方法。将本发明专利技术的靶向环肽修饰的脂质体微泡应用于超声造影，具有较高的灵敏度。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，用作超声造影剂与 整合素α νβ 3受体结合超声显像来评估早期肝纤维化。
技术介绍
迄今，肝活检仍是评估肝纤维化的唯一 “金标准”。然而，肝活检是有创的， 可引起致命的并发症，因此不能被患者普遍接受，这造成了很大一部分慢性肝病患者在 诊断和治疗上的延误；同时，在无明显症状的患者中，很难重复进行肝活检，这就无法 准确地随访慢性肝病患者病情的变化；此外，样本取样误差和病理观察的不一致性都影 响了肝活检的准确性。因此，需要一种精确的无创伤性的方法来诊断和评估肝纤维化。 目前，肝纤维化无创伤性的评估方法有1纤维化血清标记物。器官特异性差，易受炎 症和机体代谢的干扰，标准化困难，组合指标更多反映炎症，对纤维化分期较困难；2 生化指标。需多项组合(如Fibrotest)。由于肝脏极强的储备功能，只在严重肝纤维化 时改变明显，并且生化指标影响因素多，解释困难，不同病因、不同时期的肝纤维化评 估的准确性不同；3常规影像。目前常规B超、CT、MRI难于反映肝纤维化早期改变， 评估多限于肝硬化及并发症；4发展中的影像技术。近年推出超声检测低频弹性波的瞬 时弹性记录仪(Fibroscan)和运用MRI弥散加权成像(DWI)、31磷波谱成像(31MRS)及 弹性成像变化等新技术，通过测量肝组织硬度和弹性来评估肝脏纤维化程度，优于其他 的无创的方法，具有一定的应用前景。然而，近来的研究发现也存在一定的局限性，如 腹壁脂肪的含量在很大程度上影响Fibroscan等对肝纤维化的检测准确性，并且这些方法 在对早期肝纤维化的诊断上也存在困难。综上所述，目前诊断和评估肝纤维化的方法都未能较好反映慢性肝损伤修复过 程中活化细胞表型和数量变化等分子病理改变，并在可靠性、敏感性、可操作性等方面 存在不一致性，尚难达到临床对肝纤维化早期诊断和治疗效果实时动态评估的要求。不 能对肝纤维化做出正确评估一直以来是制约基础研究走向临床的“瓶颈”，也是不能开 发抗纤维化药物与临床试验的关键环节。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种能提高超声显影的灵敏度的脂质体微泡及其制备方 法。为了达到上述目的，本专利技术提供了一种靶向环肽修饰的脂质体微泡，包括带有 链酶亲和素的脂质体微泡，其特征在于，所述脂质体微泡通过链酶亲和素与生物素的亲 和作用连接生物素-聚乙二醇-可与肝纤维化或肝硬化中新生血管内皮细胞表面上的受体 相结合的靶向环肽。脂质体微泡中包裹氮气和全氟碳的混合物，起到超声显影作用。所述的肝纤维化或肝硬化中新生血管内皮细胞表面上的受体为至少一种在病理 状态下上调的受体，如整合素α νβ 3受体。所述的靶向环肽为环(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-酪氨酸-赖氨酸)，即 C(RGDyK)，其可以特异性结合肝星状细胞，从而达到特异性肝纤维化诊断并提高诊断 灵敏度的目的。环肽中的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列是新生血管内皮细胞 多种整合素受体结合位点。其中，y代表右旋酪氨酸残基，K代表赖氨酸残基且不影响 与靶向受体结合。本专利技术还提供了上述靶向环肽修饰的脂质体微泡的制备方法，其特征在于，具 体步骤为第一步将摩尔比为1.1 1.3: 1的靶向环肽与生物素-聚乙二醇-N-羟基琥珀 酰亚胺酯共同溶解于pH=8的磷酸盐缓冲液中，室温搅拌1-5小时，过滤，得到靶向环 肽-聚乙二醇-生物素粗品，用制备型HPLC纯化，冷冻干燥得纯品；第二步在冰上将第一步得到的靶向环肽-聚乙二醇-生物素纯品和带有链酶亲和 素的脂质体微泡分别溶解于生理盐水中，将上述两种生理盐水溶液混合，得到靶向环肽 修饰的脂质体微泡。所述的C(RGDyK)的制备方法如下利用芴甲氧羰基固相多肽合成方法，以 0-(ΙΗ-苯并三唑-1-基)-Ν,Ν,Ν',Ν’-四甲基异脲六氟化磷和二异丙基乙胺为缩合剂，依 次在芴甲氧羰基-甘氨酸-二氯三苯甲基树脂上(Fmoc-Gly-2-CKTrt resin)接入侧链 保护的精氨酸(R)、赖氨酸(K)、d_酪氨酸(y)和天冬氨酸(D)，经1%三氟乙 酸(TFA)切割后得到侧链保护的线状肽链D (otBu) -Y (tBu) -K (Boc) -R (Pbf) -G。再在 DIEA的催化下，用六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(PyBOP)进行环化而 得。本专利技术的原理如下1.精氨酸一甘氨酸一天冬氨酸(arginine-glycine-asparagic acid, RGD)系列是整合素结合配基的最常见识别位点。整合素α ν β 3能识别ECM中特异构象的RGD配体。人 工合成含RGD肽链高通量筛选发现，首尾环合的精氨酸-甘氨酸_天门冬氨酸-(右旋) 酪氨酸-赖氨酸(C(RGDyK))、精氨酸_甘氨酸_天门冬氨酸-(右旋)苯丙氨酸-赖 氨酸(RGDfK)等五肽分子也能和整合素α νβ 3受体特异结合，对五肽中赖氨酸侧链上 活性氨基进行小分子修饰并不会显著影响受体与配基结合活性。在我们的前期研究中，发现活化HSCs中整合素ανβ3表达明显上调， C(RGDyK)多肽在早期肝纤维化的诊断中可以做为一种潜在的示踪剂。这部分研究 结果已经发表 SCI 文章Biochemical characterization of the binding of cyclic RGDyK to hepatic stellate cells. Xiao-wei Huang, Ji-Yao Wang, et al. Biochemical Pharmacology. 2010, 80: 136-143. (IF=4.8,2008)另外，我们也发现在硫代乙酰胺(thioacetamide, TAA)和胆总管结扎(bile duct ligation, BDL)诱导的两种大鼠肝纤维化模型中，整合素α νβ 3和a_平滑肌肌动蛋白 (a-smooth muscle actin, α-SMA)表达在程度和部位上密切相关，它和肝纤维化的发展 趋势是一致的。并已经进行了 SPECT显像的初步体内研究。2.目前，国外已有不少通过以RGD环肽标记的对比剂对整合素α νβ 3受体表达 进行显像的分子影像学研究。主要工作集中在肿瘤新生血管、血管损伤重塑、破骨细胞 参与的骨重建等方面。虽然常规超声难以在早期诊断肝纤维化，但是超声微泡的应用极大地改善了声学图像，而且靶向超声微泡的应用可使超声影像拓展到分子影像领域，造 影定量分析软件可采集研究区域内的序列动态造影影像，分析其内各像素及造影剂气泡 回波的量的变化，从而可获得反映细胞功能变化的血流参数。国外曾应用此技术了解整 合素α νβ 3在实验性肿瘤血管新生时的表达及干预后改变。而在肝纤维化中，目前未见 相关的研究报道。本专利技术的优点是1.分子成像技术的优点在于它能从空间和时间上对活体生物学过程进行量化，避免 抽样误差并弥补组织学分析不能提供功能信息的缺陷；另外，由于分子影像学手段可以 对同一动物的分子表达模式进行动态研究，所以可以大大减少对动物的需求并增加研究 结果的可信度。2.超声波成像技术在若干方面优于其他成像模式。例如，超声成像是瞬间和实 时的，而其他大多数成像程序的完成时间通常要以分钟计算。与核医学及CT技术不同， 超声成像无需使用电离辐射。尽管核磁共振本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种靶向环肽修饰的脂质体微泡，包括带有链酶亲和素的脂质体微泡，其特征在于，所述脂质体微泡通过链酶亲和素与生物素的亲和作用连接生物素－聚乙二醇－可与肝纤维化或肝硬化中新生血管内皮细胞表面上的受体相结合的靶向环肽。
【技术特征摘要】
1.一种靶向环肽修饰的脂质体微泡，包括带有链酶亲和素的脂质体微泡，其特征在 于，所述脂质体微泡通过链酶亲和素与生物素的亲和作用连接生物素-聚乙二醇-可与肝 纤维化或肝硬化中新生血管内皮细胞表面上的受体相结合的靶向环肽。2.如权利要求1所述的靶向环肽修饰的脂质体微泡，其特征在于，所述的肝纤维化或 肝硬化中新生血管内皮细胞表面上的受体为整合素。3.如权利要求1所述的靶向环肽修饰的脂质体微泡，其特征在于，所述的整合素为整 合素ανβ304.如权利要求1所述的靶向环肽修饰的脂质体微泡，其特征在于，所述的靶向环肽为 带有精氨酸_甘氨酸_天冬氨酸序列的环肽。5.如权利要求1所述的靶向环肽修饰的脂质体微泡，其特征在于，所述的带有精氨 酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的环肽为环(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-酪氨酸-赖氨酸)。6.如权利要求5所述的靶向环肽修饰的脂质体微泡，其特征在于，所述的环(精氨 酸_甘氨酸_天冬氨酸_酪氨酸_赖氨酸)的制...
【专利技术属性】
技术研发人员：王吉耀，陆伟跃，黄晓伟，谢操，
申请(专利权)人：复旦大学附属中山医院，复旦大学，
类型：发明
国别省市：31
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