一种同时制备毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷化学对照品的方法技术

本发明专利技术涉及一种同时制备毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷化学对照品的制备新工艺。黄芪醇提物，经硅胶柱色谱富集、树脂柱除杂、制备高效液相色谱三步纯化，即可获得纯度大于９８％的毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷两种化学对照品。本发明专利技术工艺步骤简单、纯度高、色泽好，并且易规模化生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种同时制备毛蕊异黄酮苷 (CalyCOSin-7-0-i3-D-gluCOSide)、芒柄花苷(Ononin)化学对照品的制备新工艺。主要包 括硅胶柱色谱富集、树脂柱除杂及反相高效液相制备色谱三步纯化。
技术介绍
黄芪为临床常用中药，有补气升阳、固表止汗、利水消肿等功效，所含的皂苷和黄 酮类成分为其主要活性成分。毛蕊异黄酮苷和芒柄花苷是黄芪中含量较高的两个黄酮苷 类化合物，2010版中国药典已将毛蕊异黄酮苷作为黄芪的质控指标成分之一。由于该化 合物极性较大，获取高纯度对照品较为困难，因此市场上该对照品价格昂贵(1250-1800元 /10mg)，且经常处于缺货状态。黄芪为临床大宗药材，使用量较大，缺少高纯度对照品严重 影响了黄芪等相关制品的质量评价、生产销售及制约了相关新药的研发步伐。发展高纯度 毛蕊异黄酮苷及芒柄花苷的高效制备方法，尤其规模化制备技术具有重要意义。目前，从黄芪中制备黄酮苷类化合物的报道较少，中国专利(CN00710176318. 5) 报道采用萃取、树脂层析富集及反复重结晶等获取纯度约为97%的毛蕊异黄酮苷，其中重 结晶的次数为5-7次，过程较繁琐且重结晶损失量较大。而同时获取规模化毛蕊异黄酮苷 和芒柄花苷的制备研究未见文献报道。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种工艺简单、易规模化的制备新方法，可以以黄芪粗提物为原 料，同时制备纯度大于98%的毛蕊异黄酮苷和芒柄花苷两种化学对照品，制备规模为克级 到10克级。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案1)硅胶柱色谱富集黄芪醇提物，硅胶柱色谱分离，乙酸乙酯、甲醇混合溶剂洗脱，洗脱物减压干燥得 棕黄色粉末；2)树脂柱除杂棕黄色粉末用低浓度乙醇溶液溶解，树脂柱分离，先以水溶液洗脱除去杂质，乙醇 溶液台阶梯度洗脱，其中乙醇的体积分数为25-55%，分别收集25-35%洗脱物(毛蕊异黄 酮苷粗品)，45-55%洗脱物(芒柄花苷粗品)；3)反相高效液相制备色谱精制 上述粗品用体积分数为40-60%的甲醇溶液溶解，微孔滤膜过滤，反相高效液相制 备色谱分离，以甲醇-水溶液为洗脱体系，紫外检测器254nm监测，收集各自制备图谱中主 要的色谱峰，干燥即可得到纯度大于98%的两个对照品，其外观为白色粉末。所述步骤1)的具体过程为，硅胶柱色谱采用的洗脱剂为乙酸乙酯和甲醇的混合 溶剂，其比例为9 1-7 3。所述步骤幻的具体过程为，树脂柱上样样品用体积分数不高于25%的乙醇溶液溶解，采用的树脂为HPD 100或Diaion，各台阶梯度洗脱的体积为3_5倍柱体积。所述步骤幻的具体过程为，制备高效液相采用的流动相为体积分数为40-50%的 甲醇水溶液。以本专利技术从天麻中分离毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、黄芪甲苷化学对照品具有如下 优点和进步1)本专利技术工艺简单、收率高，且可同时获取两个高纯度对照品。第一步采用硅胶柱富集，可直接将黄芪中的脂溶性苷元和苷类分开，同时除去部 分强极性杂质；第二步采用树脂柱除杂，可获取含量约为80% (HPLC归一化法)的毛蕊异 黄酮苷和芒柄花苷粗品，同时树脂有脱色的功效。第三步采用反相高效液相制备，可获取高 纯度对照品，且收率较高(> 85% )。2)本专利技术采用的技术手段非常适宜放大进行规模化生产。原料要求不高，一般市售粗提物即可，易于批量备料；第一步粗分离采用硅胶柱富 集，填料便宜易得；第二步采用树脂柱除杂，树脂柱可以再生循环使用且树脂价格低廉，易 于规模化；第三步精制中采用反相高效液相制备，发展的制备方法为快速的等度方法，也非 常适宜放大规模生产。附图说明图1为经硅胶柱富集后毛蕊异黄酮苷和芒柄花苷的HPLC分析图谱OMnm)图2为经树脂柱除杂后毛蕊异黄酮苷的HPLC分析图谱OMnm)图3为经树脂柱除杂后芒柄花苷的HPLC分析图谱QMnm)图4为高纯度毛蕊异黄酮苷的HPLC分析图谱QMnm)图5为高纯度芒柄花苷的HPLC分析图谱QMnm)具体实施例方式现结合实施例和附图对本专利技术做进一步详细说明，实施例仅限于说明本专利技术，而 非对本专利技术的限定。实施例11)硅胶柱色谱富集黄芪醇提物100g，硅胶减压色谱0lcm*12cm)分离，5倍柱体积的乙酸乙酯甲 醇(9 1)洗脱，500ml每份收集流份，薄层色谱检测，其中展开剂为乙酸乙酯甲醇水 (9:1: 0.5)，显色剂为体积浓度5%的硫酸乙醇溶液，合并Rf值为0.4-0.6的流份，减压 干燥得棕黄色粉末750mg(图1)；2)树脂柱除杂棕黄色粉末用10%乙醇溶液溶解，四层纱布过滤，清液上HPD-100树脂柱分离，其 中样品树脂比例为1 6(g ml)，分别以5倍柱体积的水、25%乙醇溶液、45%乙醇溶液 洗脱，分别收集25%乙醇洗脱物，浓缩干燥得毛蕊异黄酮苷粗品200mg(图2、；收集45%洗 脱物，浓缩干燥得芒柄花苷粗品25mg(图3)；3)反相高效液相制备色谱精制上述粗品用体积分数为40 %的甲醇溶液溶解，配置样品浓度为50mg/ml，经0. 45 μ m微孔滤膜过滤；滤液采用柱长10cm、直径2cm的高效液相制备色谱柱进行分离，制 备色谱柱的填充填料为6μπι ClS(Novapak)；毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷的进样体积分别为 4ml和0. 5ml，采用的流动相为体积分数为40 %的甲醇-水溶液，流速控制在lOml/min，紫 外检测器254nm监测，收集各自制备图谱中主要的色谱峰，60°C减压干燥即可得到纯度大 于98 %的毛蕊异黄酮苷92mg，芒柄花苷10mg，收率约为89 %，它们的外观为白色粉末(图 4，图 5)。实施例21)硅胶柱色谱富集黄芪醇提物lOOOg，硅胶柱色谱(8cm*80cm)分离，4倍柱体积的乙酸乙酯甲 醇(8 2)洗脱，500ml每份收集流份，薄层色谱检测，其中展开剂为乙酸乙酯甲醇水 (9:1: 0.5)，显色剂为5%的硫酸乙醇溶液，合并Rf值为0.4-0.6的流份，减压干燥得棕 黄色粉末7. 4g ；2)树脂柱除杂棕黄色粉末用25 %乙醇溶液溶解，四层纱布过滤，清液上Diaion树脂柱分离，其 中样品树脂比例为1 5(g ml)，分别以4倍柱体积的水、30%乙醇溶液、50%乙醇溶液 洗脱，分别收集30%乙醇洗脱物，浓缩干燥得毛蕊异黄酮苷粗品1. Sg ；收集50%洗脱物，浓 缩干燥得芒柄花苷粗品MSmg ；3)反相高效液相制备色谱精制上述粗品用体积分数为50%的甲醇溶液溶解，配置样品浓度为50mg/ml，经 0. 45 μ m微孔滤膜过滤；滤液采用柱长19cm、直径7. 5cm的高效液相制备色谱柱进行分离， 制备色谱柱的填充填料为IOym ClS(Microsorb)；毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷的进样体积分 别为6ml和0. 8ml，采用的流动相为体积分数为45%的甲醇-水溶液，流速控制在160ml/ min，紫外检测器254nm监测，收集各自制备图谱中主要的色谱峰，60°C减压干燥即可得到 纯度大于98%的对照品，累计获得毛蕊异黄酮苷900mg，芒柄花苷llOmg，收率约为87%，它 们的外观为白色粉末。实施例31)硅胶柱色谱富集黄芪醇提物2000g，硅胶柱色谱(9. 5cm* 120cm)分离，3倍柱体积的乙酸乙酯甲 醇(7 3)洗脱本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种同时制备毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷化学对照品的方法，其特征在于：黄芪醇提物，经硅胶柱色谱富集、树脂柱除杂、制备高效液相色谱三步纯化，即可获得纯度大于９８％的毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷对照品；具体步骤如下：１）硅胶柱色谱富集：黄芪醇提物，硅胶柱色谱分离，乙酸乙酯、甲醇混合溶剂洗脱，洗脱物减压干燥得棕黄色粉末；２）树脂柱除杂：棕黄色粉末用低浓度乙醇溶液溶解，树脂柱分离，先以水溶液洗脱除去杂质，乙醇溶液台阶梯度洗脱，其中乙醇的体积分数为２５－５５％，分别收集２５－３５％洗脱物（毛蕊异黄酮苷粗品），４５－５５％洗脱物（芒柄花苷粗品）；３）反相高效液相制备色谱精制：上述粗品用体积分数为４０－８０％的甲醇溶液溶解，微孔滤膜过滤，反相高效液相制备色谱分离，以甲醇－水溶液为洗脱体系，紫外检测器２５４ｎｍ监测，收集各自制备图谱中主要的色谱峰，干燥即可得到纯度大于９８％的两个对照品，其外观为白色粉末。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：肖红斌，王莉，彭杰，卓荣杰，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：91[中国|大连]