虎纹捕鸟蛛毒素－ＸＶＩ制造技术

本发明专利技术公开了一种虎纹捕鸟蛛毒素－ＸＶＩ，是从虎纹捕鸟蛛粗毒中经离子交换和反相高效液相色谱分离提纯得到的，其一级结构由３９个氨基酸残基组成，含有６个半胱氨酸并形成三对二硫键，分子量为４４３７．４Ｄａ；该毒素纯化冻干粉的理化性状为白色或类白色疏松体，无气味，极易溶解于水，水溶液近于无色透明；对大鼠背根神经元Ｎ－型钙通道的半数最大抑制浓度为６０ｎｍｏｌ／Ｌ，是一种很强的选择性作用于Ｎ－型钙通道的抑制剂。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种虎纹捕鸟蛛毒素。
技术介绍
痛觉是一种与组织损伤或潜在的损伤相关的不愉快的情感体验和主观感觉，它 是感觉神经系统的功能，是机体自我保护的一种反射机制。多肽类钙通道抑制剂广泛存在 于蜘蛛、芋螺和蝎子等有毒动物的毒液中，具有开发成治疗人类疾病的镇痛新药的应用前 景。例如，ω-芋螺毒素MVIIA是研究比较清楚的脊椎动物神经元N-型钙通道阻断剂，通 过堵塞其受体孔道而达到目的。ziconotide (合成的ω-芋螺毒素MVIIA)作为一种治疗 严重慢性疼痛的新型非阿片类新药已于2004年被美国食品和药物管理局获准出售。因此， 全世界都将精力转移到开发不以阿片类受体为靶点的强效镇痛药。
技术实现思路
本专利技术旨在于提供一种能明显抑制哺乳动物N-型钙通道的虎纹捕鸟蛛毒 素-XVI。本专利技术虎纹捕鸟蛛毒素-XVI，是从虎纹捕鸟蛛粗毒中经离子交换和反相高效液相 色谱分离提纯得到的，其多肽的氨基酸序列如下Cys lie Gly Glu Gly Val Pro Cys Asp Glu Asn Asp Pro Arg Cys Cys Ser Gly Leu Val Cys Leu Lys Pro Thr Leu His Gly lie Trp Tyr Lys Ser Tyr Tyr Cys Tyr Lys Lys0本专利技术提供的这种虎纹捕鸟蛛毒素-XVI (HWTX-XVI)其一级结构由39个氨基酸 残基组成，其中含6个半胱氨酸并形成三对二硫键，分子量为4437. 4 Da,该毒素纯化冻干 粉的理化性状为白色或类白色疏松体，无气味，极易溶解于水，水溶液近于无色透明；对大 鼠背根神经元N-型钙通道的半数最大抑制浓度为60 nmol/L,它是一种很强的选择性作用 于N-型钙通道的抑制剂，具有低毒性和可逆性，能有效抑制哺乳动物N-型钙通道，有希望 成为开发治疗N —型钙通道相关疾病的先导分子。附图说明图1是虎纹捕鸟蛛粗毒阳离子交换HPLC图谱。箭头表示目的峰，纵坐标表示洗脱 峰在观0 nm的吸收值，横坐标表示洗脱时间。图2是虎纹捕鸟蛛粗毒目的阳离子交换峰反相HPLC图谱。“*”表示目的峰，纵坐 标表示各个洗脱峰在观0 nm下的吸收值，横坐标表示洗脱时间。图3是HWTX-XVI的反相HPLC图谱。图 4 是 HWTX-XVI 的 MALDI-T0F 质谱图谱。图5是1 uM HWTX-XVI对大鼠输精管收缩的影响。1 uM HWTX-XVI能快速抑制低 频率电刺激诱导的大鼠输精管收缩，而且这种抑制作用是可逆的。图6是HWTX-XVI抑制大鼠输精管收缩的浓度依从性。浓效曲线均用Hill方程进行拟合得出IC5Q。方程y=l-(l-/max)/(1 + ( /IC50),中，ζ代表毒素浓度，IC5tl代表毒 素半数有效抑制浓度，~是Hill常数。图7是10 mM HWTX-XVI对低电压激活钙电流的影响。图8是10 mM HWTX-XVI能明显抑制高电压激活钙电流。图9是HWTX-XVI不能进一步阻断GVIA —不敏感的电流。图10是在细胞外液中存在HWTX-XVI时，GVIA不能抑制电流。图11是MVIIA可阻断部分HWTX-XVI不敏感钙电流。图12是HWTX-XVI对钙通道电流-电压关系(I_V curve)的影响。图13是HWTX-XVI抑制N-型钙通道的浓度依赖性。图中每个点的数据来自于5 8个实验细胞，用平均值士标准误(mean士S. E.)来表示。浓度曲线均用Hill方程进行拟 合得出IC5Q。方程y=l_(l_fmax)/(1 + ( /IC50),中，ζ代表毒素浓度，IC5tl代表毒素半 数有效抑制浓度，~是Hill常数。图14是HWTX-XVI抑制N-型钙通道的时间依从性。具体实施例方式1、实验1. 1虎纹捕鸟蛛粗毒的分离纯化虎纹捕鸟蛛粗毒的分离纯化分三步进行(1)阳离子交换柱层析，在Waters650E色谱 系统上进行，层析柱子采用Waters P-I型阳离子交换柱(10 mmXIOO mm)。称取10 mg粗 毒，溶于1 mL双蒸水，并于台式高速离心机(国产)上离心10 min (转速为10，000 rpm)， 沉淀不溶物。取上清液进样，在配备有486紫外检测器的Waters 650 E高级蛋白质纯化 系统上，采用Waters CM (300 nm)填料，使用常压自装柱(10 mm X 100 mm)进行阳离子 交换层析。采用四元梯度洗脱(A)0. lmol/L磷酸二氢钠；(B)O. 1 mol/L磷酸氢二钠；(C) 1.0 mol/L氯化钠；(D)双蒸水(ddH20)。其中A液和B液用来调节洗脱液的pH值，采用氯 化钠梯度洗脱。在观0 nm波长室温检测并收集所有被洗脱峰，找出目的峰后再进一步进行 反相脱盐处理。脱盐纯化在Waters 515 pump & Empower高效液相色谱工作站，2487检测 器上进行。采用分离柱为Phenomenex C18柱(4. 6 mm X 250 mm)。一次进样200 300 mL。先用100% ddH20 (含0. 1%TFA)冲洗20 min，将混在样品中的盐分洗涤干净(紫外检测 吸收值为零)之后，用乙腈(含0.1%TFA)溶液进行梯度洗脱。流速为3.0 mL/min，检测波长 为观0/215 nm，柱温为室温。收集每个洗脱峰，用质谱鉴定它们所含成分的分子量，找出含 有HWTX-XVI的洗脱峰并进行冷冻干燥。最后，目的样品再在Waters 515 pump & Empower 高效液相色谱工作站，2487检测器，或者反相HPLC纯化系统(Waters公司，AlIiance 2690 HPLC & Millennium32高效液相色谱工作站)，996 PDA检测器上进行纯化。分离柱为 Phenomenex (18柱(4.6 匪 X 250 mm);洗脱液分别为A液(0. 1 % TFA/H20)、B液(0. TFA/CAN),流速为1.0 mL/min，检测波长为观0/215 nm，柱温箱温度为40°C。收集洗脱峰， 并用MALDI-T0F质谱仪鉴定样品的纯度，目的样品的冻干粉末置于-20°C冰箱储存备用。1. 2 MALDI-T0F质谱分析和氨基酸序列测定MALDI-T0F质谱分析在美国应用生物系统公司生产的Voyager-DE STR型的 MALDI-T0F Mass(Matrix-assisted Laser desorption/ionization time-of-flight)MiH仪上进行。用 50 % 乙腈、50 %水、0. 1 % TFA混合液制备 CCA(ff如acid)基质(5mg/mL)，然后分别取1. Oml样品与5ml CCA基质液混合，再取0. 5ml混合液 在质谱仪的样品盘上分别点样，室温下自然风干后测定各样品的分子量。采用反射模式， 离子源加速电压为20 kV，N2激光波长337nm，脉冲宽度3ns，离子延迟提取150ns，真空度 4' ΙΟ"7 Torr,质谱信号单次扫描累加100次，正离子模式。氨基酸序列分析是应用Edman降解原理，在Perkin Elmer Procise 491A本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种虎纹捕鸟蛛毒素－ⅩⅥ，其特征在于该毒素是从虎纹捕鸟蛛粗毒中经离子交换和反相高效液相色谱分离提纯得到的，其多肽的氨基酸序列如下：Ｃｙｓ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｃｙｓ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　ＡｒｇＣｙｓ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｔｒｐ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：梁宋平，邓梅春，肖玉成，张东裔，曾雄智，
申请(专利权)人：湖南师范大学，中国人民解放军国防科学技术大学，
类型：发明
国别省市：43[中国|湖南]