一种小分子ＤＮＡ疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种小分子ＤＮＡ疫苗及其制备方法，小分子ＤＮＡ疫苗由转录启动子和目的基因构成线性ＤＮＡ片断，目的基因包含其起始和终止密码子。与现有ＤＮＡ疫苗相比，本发明专利技术的小分子ＤＮＡ疫苗，可更快地诱导产生抗体，产生的细胞免疫水平更高。本发明专利技术的小分子ＤＮＡ疫苗，只携带真核生物基因转录启动子和目的基因或目的基因片段，不携带任何目的基因以外的无关基因或核酸序列，如抗生素抗性基因、ＰｏｌｙＡ尾巴、复制起始点等，具有更好生物安全性。由于线性ＤＮＡ疫苗的整体长度更短，更易于扩增，同时，扩增的准确性更高，疫苗的效价比也更高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种DNA疫苗及其制备方法，特别涉及一种小分子DNA疫苗及其 制备方法。
技术介绍
1990年，Wolff等(Wolff etal，1990)在对小白鼠进行基因治疗试验时，偶然 发现DNA疫苗。1992年，美国同时有四个实验室开发研究出DNA疫苗并在同年九月的 疫苗学新进展大会上同时进行了报告。自此DNA疫苗引起人们的高度重视，被认为是继 减毒、灭活疫苗和亚单位疫苗之后的第三次疫苗革命。DNA疫苗是将编码某种抗原蛋白的外源基因(DNA)与含有必要表达调控元件 的真核表达载体质粒重组后，将重组质粒DNA直接注入动物机体，并通过宿主细胞的转 录、翻译系统合成抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防和治 疗疾病的目的。DNA疫苗在传染性疾病、寄生虫和肿瘤的防治中显示出巨大潜力，它既是载体 又能在真核细胞中表达抗原，在体内抗原的表达与自然感染相似，体内表达的抗原蛋白 具有天然构象，诱导的抗体应答特征与野生病毒相似，同时诱导机体产生细胞免疫及体 液免疫反应。目前已经进行了多种病原体的DNA疫苗的研究，如流感、乙型肝炎、艾 滋病等，这些试验结果表明，DNA疫苗不仅具有预防疾病的作用，同时还具有治疗疾病 的作用。因此将为长期以来无法预防或预防不理想的传染病带来希望。它与传统疫苗的 区别，主要在于核酸疫苗的抗原蛋白是在免疫对象体内产生的，表达产物具有天然的构 象，可按照正常的途径被加工、修饰，再提呈给免疫系统，最终引起全面的免疫反应， 整个过程与病毒的自然感染或接种减毒活疫苗相同，所以核酸疫苗最大的优点既具有亚 单位疫苗和灭活疫苗的安全性，又有减毒活疫苗和重组疫苗诱导全面免疫应答能力的优 点ο现有的DNA疫苗是将目的基因克隆到质粒载体上，置于真核基因启动子的控制 之下，以此质粒DNA注射动物或人，刺激免疫反应，达到预防和治疗疾病的目的。为 筛选出有效装载的DNA质粒，现有的DNA疫苗载体上携带有其他外源基因，如用于克 隆筛选的各种抗生素基因、用于质粒复制的复制起始序列、调节基因转录或表达的增强 子、提高免疫效果的免疫调节基因、标记基因如绿色荧光蛋白(GFP)基因和β半乳糖 甘酶基因等。由于所携带的基因或DNA序列过多，将会出现许多弊病其一是其他抗原 的表达，可能对机体造成危害或不确定性；其二是因为其他基因的表达，与目的基因的 表达形成了资源竞争，导致免疫效果降低；其三也是最重要的是过多其他基因或非最必 须DNA序列的存在构成了很大的生物安全问题，增加了外源DNA整合到宿主基因组中 的几率，增加了诱发肿瘤等问题的机会，使DNA疫苗的使用存在的不确定性大为增大； 另外在有过多其他基因或非最必须DNA序列的存在的情况下，单位质量内的DNA的拷 贝数相应降低，这将降低DNA疫苗的免疫效率，也将提高疫苗的生产成本，同时载体上携带的其他外源基因可能影响目的抗原蛋白加工、修饰从而形成天然构象。理论上传统的DNA疫苗只使用超螺旋或环状的质粒DNA作为载体，并不使用 线性DNA或用PCR技术扩增出的线性DNA，因此现有的DNA疫苗可以称为质粒DNA 疫苗(Plasmid DNAVaccine, pDNAVaccine)。线性DNA在体内易于降解，一般认为在体内不能有效的表达，不可作为疫苗 或其他基因制剂使用。在我们之前的专利申请中(专利申请号200610033861.5)，突 破常规，将真核生物基因转录启动子和转录终止子与目的基因相连，得到一种短链线性 DNA,并发现该种DNA在动物体内可以有效的表达，可作为DNA疫苗或其他基因制剂 使用。同时，与质粒DNA疫苗相比，该申请的线性DNA疫苗具有更好的安全性，效价 更高等优点。该申请中公开的DNA分子中，一定要含有完整的启动子、目的基因和终止子， 其长度较常规的质粒DNA疫苗虽然有很大的降低，但是其总体长度依然是比较可观的， 现有的PCR技术难以保证其扩增的准确性。
技术实现思路
一种小分子DNA疫苗，由转录启动子和目的基因构成线性DNA片断，目的基 因包含其起始和终止密码子。优选的，转录启动子为真核基因转录启动子。上述小分子DNA疫苗的制备方法，包括以下步骤1)将转录启动子克隆至含有克隆位点的载体中，得到通用载体；2)将目的基因克隆到通用载体中，得到含有转录启动子和目的基因的重组载体；3)根据通用载体中转录启动子的上游序列设计通用引物，根据目的基因的下游序 列，设计下游引物，以重组载体为模板，扩增由转录启动子和目的基因构成的线性DNA 片断。优选的，含有克隆位点的载体为多克隆载体。优选的，多克隆载体为含有多克隆位点的T载体。本专利技术的小分子DNA疫苗，通过注射、喷鼻、吸入等方式施用人或动物，可以 人或动物中诱导体液性免疫和细胞性免疫，提供有效的保护。与现有DNA疫苗相比，本 专利技术的小分子DNA疫苗，可更快地诱导产生抗体，产生的细胞免疫水平更高。本专利技术的小分子DNA疫苗，只携带真核生物基因转录启动子和目的基因或目的 基因片段，不携带任何目的基因以外的无关基因或核酸序列，如抗生素抗性基因、PolyA 尾巴、复制起始点等，具有更好生物安全性。由于线性DNA疫苗的整体长度更短，更易 于扩增，同时，扩增的准确性更高，疫苗的效价比也更高。本专利技术的小分子DNA疫苗，制备方法简单，制备时间短，从将目的基因克隆到 通用载体到制备出小分子DNA疫苗，整个过程可在24小时内完成，相对于常规的疫苗制 备技术，其生产周期大大缩短。同时，本专利技术的小分子DNA疫苗，可采用成熟的PCR 技术制备，可大规模工业化生产，特别适用于传染性疾病的爆发等突发事件。附图说明图1是本专利技术小分子DNA疫苗通用载体的构建示意图。图2是本专利技术小分子DNA疫苗的制备过程示意图。 具体实施例方式下面结合实施例，进一步说明本专利技术。本专利技术小分子DNA疫苗制备过程如图1、图2所示，较为具体的制备工艺如下 针对人的巨细胞病毒CMV启动子设计引物，设计的上下游引物如下CMV 上游弓丨物 P1 5，- gcggccgccttatatattctttccca _3， (SEQ ID NO. 1) CMV 下游引物 P2: 5，-ctgacggttcactaaaccagctctgct-3， (SEQIDN0.2) pAdTrack-CMV的质粒作为克隆CMV片段的模板，用引物P1和P2扩增CMV的 CMV启动子基因，反应条件为94°C预变性5min，然后以94°C变性lmin，48°C退火 Imin, 72°C延伸1.5min，进行30个循环，最后72°C延伸IOmin ；回收纯化获得的PCR产物，克隆进入pMD18-T载体的EcoR ν克隆位点间，挑取 Amp抗性的阳性单菌落培养，提取其中的质粒后，双酶切鉴定重组质粒，然后测序证实 CMV启动子已克隆进入载体中，获得的含有CMV启动子的重组质粒命名为pCMV-T ； 将目的基团克隆入pCMV-T中，获得的重组质粒称为pCMV-T-Target ； 根据pCMV-T-Target中CMV启动子的上游序列，设计上游引物P1，根据目的基因 的下游序列，设计下游引物P4，其中上游通用引物为上游弓丨物 P1 5，- gcggccgccttatatattctttccca _3， 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种小分子ＤＮＡ疫苗，由转录启动子和目的基因构成线性ＤＮＡ片段，目的基因包含其起始和终止密码子。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：宋长绪，蔡汝健，蒋智勇，刘燕玲，
申请(专利权)人：广东省农业科学院兽医研究所，
类型：发明
国别省市：81