一种复合脂肪颗粒及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种复合脂肪颗粒及其制备方法，该复合脂肪颗粒由富含血小板血浆、人凝血酶溶液、脂肪干细胞、脂肪颗粒按照下述比例组成：２ｍｌ富含血小板血浆∶１ｍｌ人凝血酶溶液∶（２±０．５）×１０７个脂肪干细胞∶４ｍｌ脂肪颗粒。该复合脂肪颗粒可提高移植后脂肪的成活率、并减少远期吸收率，且不会出现异位纤维化结节形成等情况。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于移植材料
，特别涉及一种用于移植的复合脂肪颗粒及其制备 方法。
技术介绍
1893年Neuber完成了第一例采用多个自体游离的小脂肪块充填软组织缺损的脂 肪移植手术并取得满意的疗效，此后脂肪移植手术逐渐流行。尤其是液态硅胶注射由于众 多并发症被禁止后，人们在移植材料领域又进行了大量的探索，到20世纪80年代初，随着 脂肪抽吸技术的成熟和发展，再次掀起了自体游离脂肪移植的热潮。因自体脂肪来源丰富、 取材方便、安全可靠、无免疫排斥反应等优点，极易被患者所接受。并且对于全身脂肪堆积 明显者，可在自体脂肪移植的同时达到瘦身丰胸、完美身形、形体雕塑的良好效果。目前广泛应用于临床的脂肪移植技术，一般采用单纯的脂肪颗粒移植，即通过吸 脂获取脂肪细胞，稍微处理去除水分血液油脂等成分后，直接注射到受区。然而，由于部分 移植脂肪细胞在移植前已经被损坏或者发生坏死；移植后局部的无菌性炎症反应导致脂肪 细胞坏死、外漏脂质纤维化引起组织收缩；继发于脂肪细胞脂质丢失或去分化的非坏死性 容积缩小等等，都可引起移植脂肪细胞成活率低、吸收率较高，一年内吸收率可高达60 %以 上，并且如果移植的脂肪体积过大，重建的血供难以达到移植物中心，也将导致移植脂肪颗 粒中心坏死液化，增加吸收率，甚至发生纤维化，导致受植区域变硬。目前也有学者为了提高移植脂肪的成活率，而在移植的单纯脂肪颗粒中添加一定 量的脂肪干细胞，来减少移植的吸收率，取得了一定的效果；但个别却出现异位纤维化结节 形成的情况，导致受植区出现硬的团块。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是针对上述现有技术单纯的脂肪颗粒移植后脂肪成活率低、远 期吸收率高，以及直接在移植的单纯脂肪颗粒中添加脂肪干细胞可能出现异位纤维化结节 形成等问题，提供一种新的复合脂肪颗粒，可提高移植后脂肪的成活率、并减少远期吸收 率，且不会出现异位纤维化结节形成等情况。本专利技术的另一个目的是提供一种上述复合脂肪颗粒的制备方法。为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下一种复合脂肪颗粒，由富含血小板血浆、人凝血酶溶液、脂肪干细胞、脂肪颗粒按 照下述比例组成2ml富含血小板血浆Iml人凝血酶溶液0士0.幻X IO7个脂肪干细胞^il 脂肪颗粒。其中富含血小板血浆(PRP，platelet rich plasma)是将全血经过浓集、分离得到的成 分血液制品，其中血小板浓度为(1300. 00士400. 00) X 109/L。目前富含血小板血浆的制备方法已较为成熟，已有专用仪器(如多功能医用血成分的自动分离设备)可以快速、便捷、 有效的制备得到。人凝血酶溶液是采用氯化钙溶液溶解的人凝血酶，在本专利技术中作为激活PRP凝 结及释放多量生长因子的催化剂。其制备方法较为固定简单，其组分比例为1ml蒸馏 水0. Ig氯化钙800 1200单位人凝血酶冻干粉(人凝血酶的比例参照常规配比方法， 其小范围的波动对产品的质量及效果无特殊影响)。脂肪干细胞(ASCs，adipose-derived stem cells)是脂肪组织中含有的大量 具有多向分化潜能的细胞群，由国际脂肪应用技术协会(International Fat Applied Technology Society)将其统一命名为脂肪来源的干细胞(adipose-derived stem cells, ASCs)，简称脂肪干细胞。目前对于脂肪干细胞的研究已经较为普遍，对于其培养主要采用 组织块培养法和消化培养法。脂肪颗粒是通过吸脂获取的脂肪细胞。目前对于脂肪细胞获取公认的方法是采用 手动针吸法获取，并采用低于50g的离心力离心2分钟，去尽上层的油脂和水分，制备好后 可以置于4°C下保存3天。本专利技术复合脂肪颗粒可通过包括下述主要步骤的方法制得(1)、制备富含血小板血浆(PRP)抽取抗凝全血，通过两次离心法得到富含血小板血浆(PRP)，方法可如下用预先装有0.5ml 3. 8%枸橼酸三钠抗凝剂的5ml注射器，抽取4.5ml全血，摇勻， 移入离心管中，进行两次离心。第一次离心速度为lOOOr/min，时间为15分钟。离心后血 液分为三层最上层为血浆层、中间层包括血小板和白细胞(棕黄层)、最下层为红细胞层。 弃去最下层的红细胞，吸取上层和中间层至另一离心管，进行二次离心，速度为2000r/min， 时间为15分钟，弃去最上层的大部分血浆，剩余约0. 5ml液体，将其摇勻，即得到PRP。PRP制备全过程应严格无菌。(2)、制备人凝血酶溶液按照Iml蒸馏水0. Ig氯化钙800 1200单位人凝血酶冻干粉的组分比，将 人凝血酶冻干粉置于无菌的10%氯化钙溶液中配制成人凝血酶溶液，用于激活血浆中血小 板及促进血浆凝结；(3)、分离培养脂肪干细胞(ASCs)由于人脂肪中成熟脂肪细胞和油脂较多，不利于组织块培养，油脂和多余的脂肪 细胞容易损耗大量培养基，本专利技术中优选采用消化培养法，通过此法可以尽量去除脂肪细 胞和油脂对于干细胞的生长和贴壁的影响。在无菌条件下抽取脂肪，浸于生理盐水中，于抽取后池内在超净工作台中，用2倍 体积的PBS缓冲液(PBS-T)冲洗至少3次，以除去血液、油脂，然后将组织剪碎，加入等体积 的1 % I型胶原酶，混勻后于37°C恒温摇床振荡消化60分钟，1000r/min离心8分钟，吸除 表面漂浮油脂、脂肪组织及液体，将沉积于管底的物质接种于25cm2培养瓶中，加入α -MEM 培养基(含10 %胎牛血清，1 %双抗)，置入37 °C、饱和湿度、5 % (X)2的孵箱中培养，3天后加 2ml液(即培养基，下同)，7天后换液，清除未贴壁的细胞及组织块。原代细胞培养15 20d即可融合。细胞长满80% (指培养瓶底面积的80%，下同)时，以0.25%胰酶消化、传 代。传代细胞继续加入α -MEM培养基，置入37°C、饱和湿度、5% CO2的孵箱中培养，倒置相CN 102058905 A说明书3/8页差显微镜下观察细胞生长情况，每3天换一次液。待细胞生长至60%时，以0. 25%胰酶消 化、离心、收集底部沉积的脂肪干细胞待用。0)、制备脂肪颗粒在无菌条件下抽取脂肪，采用2倍体积的生理盐水冲洗至少3次，以去除血液、水 分、油脂等，通过1000转/分钟低速离心2分钟，进一步去除血液、水分、油脂等成分，得到 纯净的脂肪颗粒；(5)、混合、制得复合脂肪颗粒将上述各步骤制得的富含血小板血浆(PRP)、人凝血酶溶液、脂肪干细胞(ASCs)、 脂肪颗粒按照anl Iml Q±0.5)X107个的比例充分混合均勻，即得到本专利技术 所述的复合脂肪颗粒。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是本专利技术通过在纯净脂肪颗粒中添加适当比例的富含血小板血浆、人凝血酶溶液和 脂肪干细胞，通过人凝血酶溶液对PRP中血小板的激活，释放大量生长因子，可以促进细胞 增殖及移植物周边毛细血管的增殖，从而保证移植脂肪早期血供，防止脂肪细胞坏死液化。 同时PRP凝结后形成丰富的纤维网络对促进细胞粘附和防止细胞流式均具有一定的作用。 而脂肪干细胞其不仅自身能分化为脂肪细胞促进脂肪组织再生，而且可以分化为血管内皮 细胞促进血管生成，并且在移植后的缺氧的急性状态下可以改善局部组织缺血的情况。这 些作用都可以促进本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种复合脂肪颗粒，由富含血小板血浆、人凝血酶溶液、脂肪干细胞、脂肪颗粒按照下述比例组成：２ｍｌ富含血小板血浆∶１ｍｌ人凝血酶溶液∶（２±０．５）×１０↑［７］个脂肪干细胞∶４ｍｌ脂肪颗粒。

【技术特征摘要】
1.一种复合脂肪颗粒，由富含血小板血浆、人凝血酶溶液、脂肪干细胞、脂肪颗粒按照 下述比例组成2ml富含血小板血浆Iml人凝血酶溶液0士0.幻X 107个脂肪干细胞脂肪颗粒。2.根据权利要求1所述的复合脂肪颗粒，其特征在于所述的富含血小板血中，血小板 浓度为(1300. 00 士400. 00) X 109/L。3.根据权利要求1所述的复合脂肪颗粒，其特征在于所述的人凝血酶溶液的组分比 例为Iml蒸馏水0. Ig氯化钙800 1200单位人凝血酶冻干粉。4.权利要求1-3中任一项所述的复合脂肪颗粒的制备方法，包括下述主要步骤 (1)、制备富含血小板血浆抽取抗凝全血，通过两次离心法得到富含血小板血浆； O)、制备人凝血酶溶液按照Iml蒸馏水0. Ig氯化钙800 1200单位人凝血酶冻干粉的组分比，将人凝 血酶冻干粉置于无菌的10%氯化钙溶液中配制成人凝血酶溶液； (3)、分离培养脂肪干细胞在无菌条件下抽取脂肪，采用组织块培养法或消化培养法分离培养脂肪干细胞； G)、制备脂肪颗粒在无菌条件下抽取脂肪，去除血液、水分、油脂，得到纯净的脂肪颗粒； (5)、混合、制得复合脂肪颗粒将上述各步骤制得的富含血小板血浆、人凝血酶溶液、脂肪干细胞、脂肪颗粒按照 2ml Iml O±0.5)X107个的比例充分混合均勻，即得到本发明所述的复合脂肪颗粒。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述的步骤(1)制备富含血小板血 浆的方法如下用预先装有0. 5ml 3. 8%枸橼酸三钠抗凝剂的5ml注射器，抽取4. 5ml全血，摇勻，移入 离心管中，进行两次离心第一次离心...

【专利技术属性】
技术研发人员：田卫东，郭丽娟，汤炜，王杭，龙洁，刘磊，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：90[中国|成都]