本发明专利技术涉及用于阿胶真伪鉴别的组合物，所述组合物包含寡核苷酸引物及探针。本发明专利技术还涉及用于阿胶真伪鉴别的实时荧光ＰＣＲ检测方法，所述方法包括使用本发明专利技术的特异性寡核苷酸引物及探针。本发明专利技术还涉及用于阿胶真伪鉴别的ＰＣＲ检测试剂盒，所述试剂盒包括本发明专利技术的特异性寡核苷酸引物和探针。本发明专利技术还涉及本发明专利技术的特异性寡核苷酸引物及探针在鉴别阿胶真伪中的应用。使用本发明专利技术的ＰＣＲ检测方法，能够简单、快速、特异且灵敏地鉴别阿胶的真伪。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体而言，本专利技术涉及用于阿胶真伪鉴别的包含寡核 苷酸引物及探针的组合物，用于鉴别阿胶真伪的实时荧光PCR检测方法，以及阿胶的特异 性寡核苷酸引物和探针在鉴别阿胶真伪中的应用。
技术介绍
阿胶在中国有数千年的食用历史，具有补血止血，滋阴养虚的功效。它是驴皮熬制 后形成的一种特殊中药材，主要成分为胶原蛋白。纯正的阿胶必需来自百分百的驴皮，方能 保证产品的营养功效。从产品特征上看，阿胶是驴的干燥皮或鲜皮经煎煮、浓缩制成的固体 胶。正品阿胶性状特征呈长方形块、方形块或丁状、块形平整，大小一致，边角整齐，表面为 黑褐色，有光泽，质硬而脆、易断，碎片对光照视呈棕色半透明状，断面光亮无油孔、气孔。砸 碎后放入杯中，加沸水适量3 5min胶块即可溶化，胶液澄清，无异物。尝之味淡微甘，气 清香。除了块状固体阿胶，阿胶产品还包括阿胶口服液、阿胶颗粒及其他含有阿胶的制品。 从原料生物分类学上看，驴(Equus asinus)属于奇蹄目马科驴属，包括非洲野驴、藏野驴、 中亚野驴、家驴等品种。其中中国饲养的家驴包括华北驴、西南驴、新疆驴、庆阳驴、淮阳驴、 泌阳驴、广灵驴、晋南驴、关中驴等众多地方种。目前市场上存在大量通过非法渠道获得的假冒伪劣阿胶产品，其原料主要来自 猪、马、牛等动物的皮、骨、结缔组织等。这些伪品的存在严重干扰了市场正常秩序，损害消 费者利益，影响正规产品的信誉。为了取缔和预防假冒伪劣阿胶产品，需要质量监管部门加 大执法力度，而首要前提是要具备科学可靠的检测方法。目前报道的阿胶鉴别方法主要依靠感官检测，包括阿胶的色泽，切面纹理，水溶 性，气味或风味等。但感官指标容易带来判断不准确、缺乏足够说服力等情况。聚合酶链式反应(PCR)是通过扩增待测样品的DNA，使其能够从最初的微小数量 增至足以达到检测限量的巨大数量。PCR方法已用于多种多样的基因检测中。实时荧光PCR 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号来实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲 线对未知模板浓度进行定量分析，使PCR技术从定性水平发展到定量水平。近几年，在分子 生物学研究中，利用定量PCR对基因表达结果进行检测，获得了应用。由于其大大提高了检 测的灵敏度、特异性和精确性、并能有效地减少实验过程中产生污染的危险，目前已广泛应 用于各个领域。近年国内有科研机构开展了 PCR-RFLP方法的研究，但检测对象无法直接针对阿 胶产品。因为阿胶在制作过程中，经过高温煮沸等高强度处理，DNA降解严重，很难扩增出 长片段PCR产物。这种情况非常不利于对市场阿胶产品的监管。因此，本领域需要一种快速、特异性好、灵敏度高的保健品阿胶的真伪检测方法。
技术实现思路
本专利技术的一个目的在于，提供快速鉴别阿胶真伪的特异性寡核苷酸引物及探针。本专利技术的另一个目的在于，提供快速鉴别阿胶真伪的实时荧光PCR检测方法。本专利技术的再一个目的在于，提供用于快速鉴别阿胶真伪的试剂盒。本专利技术的再一个目的在于，提供本专利技术的特异性寡核苷酸引物和探针在鉴别阿胶 真伪中的应用。针对上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案本专利技术的专利技术人根据驴细胞色素b基因，设计了能够特异性地鉴别阿胶真 伪的驴特异性寡核苷酸引物对和探针，能够从阿胶产品提取的DNA中高效扩增出一 段较短的驴特异性基因片段。根据本专利技术的一个实施方案，本专利技术提供用于鉴别阿 胶真伪的驴特异性寡核苷酸引物对及探针，所述引物对及探针是根据线粒体细胞色 素b序列在驴属与其他属、科、目动物的差异以及我国饲养的家驴不同地方种之间的 基因序列保守性特点而设计的，所述引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引 物为 cytbDON-F :actttggctccctcctagga (SEQ ID No. 1)，所述下游引物为 cytbDON-R gtgtatggctaggaataggc (SEQ ID No. 2) ；Bf^iS ^f^J cytbDON-Pb 5' atctgcctaatcctccaaa tcctaac3' (SEQ ID No. 3)，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMRA，5’端连接有一 个荧光报告基团FAM。在一个实施方式中，本专利技术于提供鉴别阿胶真伪的组合物，所述组合 物包含特异性寡核苷酸引物对和探针。在一个优选的实施方案中，本专利技术提供了用于实时 荧光PCR方法鉴别阿胶真伪的组合物，所述组合物包含驴特异性寡核苷酸引物对及探针， 其中所述驴特异性寡核苷酸引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物的碱基序列 为SEQ ID No. 1，所述下游引物的碱基序列为SEQ ID No. 2，所述探针的碱基序列为SEQ ID No. 3，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMRA，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。 根据本专利技术的另一个实施方案，本专利技术的用于阿胶真伪鉴别的组合物还进一步包含马特异 性寡核苷酸引物对和探针。优选地，在本专利技术的组合物中，所使用的马特异性寡核苷酸引 物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物为cytbHOR-F :acttcggctccctcctagg(SEQ ID No. 4)，所述下游引物为 cytbHOR-R:gtgtatggctaggaataggc(SEQ ID No. 5)；所述探针为 cytbHOR-pb :5，atctgcctaatcctccaaatcttaac3，(SEQ ID No. 6)，在探针的 3，端连接有一 个荧光淬灭基团TAMRA，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。根据本专利技术的另一个实施方案，本专利技术提供鉴别阿胶真伪的实时荧光PCR检测方 法，所述方法包括使用驴特异性寡核苷酸引物对和探针，所述引物对是根据线粒体细胞色 素b序列在驴属与其他属、科、目动物的差异以及我国饲养的家驴不同地方种之间的基因 序列保守性特点而设计的。在一个实施方案中，在本专利技术的阿胶真伪鉴别的实时荧光PCR 检测方法中，所使用的驴特异性寡核苷酸引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引 物的碱基序列为SEQ ID No. 1，所述下游引物的碱基序列为SEQ ID No. 2 ；所述探针的碱基 序列为SEQ ID No. 3，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMRA，5’端连接有一个荧光 报告基团FAM。在一个实施方案中，所述PCR扩增条件是95°C，IOmin ；95°C 15s ；60°C,lmin, 50个循环。优选地，本专利技术所使用的实时荧光PCR方法为Taqman荧光探针法。本专利技术的实时荧光PCR检测方法进一步包括使用马特异性寡核苷酸引物对和探 针。针对马和驴同科，较难区分，目前采用的RFLP方法无法直接检测阿胶产品等问题，本发 明根据马细胞色素b基因中与驴靶序列相同的位置，设计了马特异性寡核苷酸引物对和探 针，能够通过实时荧光PCR方法高效扩增马特异性基因片段，从而更准确地鉴别阿胶的真伪。在本专利技术的鉴别阿胶真伪的实时荧光PCR方法中，所使用的马特异性寡核苷酸引物对 由上游引物和下游引物组成，所述上游引物为SEQ ID No. 4，所述下游引物为SEQ ID No. 5, 所述探针为SEQ ID No. 6，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMRA，5’端连接本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于实时荧光ＰＣＲ方法鉴别阿胶真伪的组合物，所述组合物包含驴特异性寡核苷酸引物对和探针，其中所述驴特异性寡核苷酸引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物的碱基序列为ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１，所述下游引物的碱基序列为ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２，所述驴探针的碱基序列为ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．３，在探针的３’端连接有一个荧光淬灭基团ＴＡＭＲＡ，５’端连接有一个荧光报告基团ＦＡＭ。
【技术特征摘要】
用于实时荧光PCR方法鉴别阿胶真伪的组合物，所述组合物包含驴特异性寡核苷酸引物对和探针，其中所述驴特异性寡核苷酸引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物的碱基序列为SEQ ID No.1，所述下游引物的碱基序列为SEQ ID No.2，所述驴探针的碱基序列为SEQ ID No.3，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团TAMRA，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。2.根据权利要求1所述的组合物，其进一步包含马特异性寡核苷酸引物对和探针， 所述马特异性寡核苷酸引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物的碱基序列为 SEQ ID No. 4，所述下游引...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴亚君，陈颖，王斌，韩建勋，张海亮，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：11
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