乙基紫在ＤＮＡ检测中的应用制造技术

本发明专利技术涉及乙基紫（ＥＶ）在聚丙烯酰胺凝胶上对ＤＮＡ染色的方法，其中染色液为ｐＨ为６－８的含乙基紫的溶液。另外，本发明专利技术还涉及基于上述方法的在聚丙烯酰胺凝胶上检测ＤＮＡ的方法以及用于这些方法的试剂盒等。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物检测
，具体而言，本专利技术涉及乙基紫(EV)在聚丙烯酰 胺凝胶上对DNA染色的方法，其成本低、步骤简单、操作时间短、灵敏度高而且染色后 的背景颜色浅。另外，本专利技术还涉及检测DNA的方法以及用于这些方法的试剂盒等。
技术介绍
当前，在聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离DNA、蛋白质等生物大分子并使之条带显 色(可视化)，已经成为生物检测中最常用的方法之一了。其中，使在聚丙烯酰胺凝胶 上的DNA分子条带可视 化，可以采用同位素标记、荧光染料、可视有机染料和银染等。 出于灵敏性、安全性以及速度的考虑，当前最受欢迎的技术之一是荧光检测法，其使用 诸如溴化乙锭(EB)、SYBR green, SYBR gold等荧光染料，如紫外光线(UV)的照射下 发出荧光，可用于检测聚丙烯酰胺凝胶上的DNA条带[1-5]。然而，这些荧光染料都具 有一些不可克服的缺点，尤其是EB，作为一种较强的致突变剂，容易对操作者的健康产 生威胁，因而需要在操作中格外小心并采取适当的防护措施，不方便使用，而且所有荧 光染料在使DNA条带可视化时，需要紫外线等短波光线照射，也不利于观察实验结果的 操作者的健康，同时荧光检测仪器设备成本也比较高[6-8]。因此，肉眼可见、操作简单、无毒、低成本的可视有机染料成为替代荧光染料 为DNA染色的选择之一。已经有一些报道公开了可视有机染料用于聚丙烯酰胺凝胶上 DNA的染色方法，如亚甲蓝[9]、亮甲酚蓝[10]、结晶紫[11]、以及尼罗河蓝[12，13] 等。但是，这些染料染色和脱色时间长，而且灵敏度较低，普遍不如荧光染料。为此，本专利技术人经过长期实践研究，令人惊讶地在发现成本低的乙基紫(ethyl violet, EV)可用于在聚丙烯酰胺凝胶上对DNA染色，其可以在20分钟的染色时间内检 测出低至0.8-1.6ng级的DNA，灵敏度是尼罗蓝(NB)的四倍，近似甚至超过EB等荧光染 料的灵敏度。EV在现有技术中被报道用于对哺乳动物组织、蛋白质进行染色[14-17]， 但是未见有报道用于对聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离的DNA染色。本专利技术人还优化出了使 用EV对在聚丙烯酰胺凝胶上对DNA染色的方法，其可以在短至20分钟的时间内以染色 这样简单的步骤完成而仍旧能够保持近似甚至超过EB等荧光染料的灵敏度。另外，本发 明人还专利技术了基于上述染色法的检测DNA的方法以及用于这些方法的试剂盒等。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供EV染色法，其能对在聚丙烯酰胺凝胶中的DNA染色， 该方法安全、操作方便、成本低，而且灵敏度高，达到甚至超过EB等荧光染料的灵敏 度。另外，本专利技术的目的还在于提供检测DNA的方法以及用于这些方法的试剂盒等。具体而言，在第一方面，本专利技术的目的在于提供在聚丙烯酰胺凝胶上对DNA染 色的方法，其特征在于，所述方法包括将聚丙烯酰胺凝胶浸入pH为5.5-9的含乙基紫的 染色液中染色。本专利技术第一方面的方法通常在聚丙烯酰胺凝胶电泳分离DNA后使用，对 聚丙烯酰胺凝胶上的DNA条带进行染色，尽管不优选，但是该方法也可以在用其他方式使DNA包裹在聚丙烯酰胺凝胶中之后使用。 EV是一种无毒性的三苯甲烷染料，其结构式如图1所示。本专利技术人经研究发 现，EV的分子结构和DNA分子具有很强的亲和力，但是EV分子结构和聚丙烯酰胺结合 的能力则弱得多，从而能够使DNA(相对于聚丙烯酰胺凝胶基质)显出颜色；而且其对 DNA的显色能力受pH这样的环境因素影响很大。如图2B所示，在小于5.5的酸性环境 下以及在大于9的碱性环境下，EV对DNA的显色强度都急剧下降。在酸性环境下的下 降可能是由于DNA骨架上的磷酸基团上所带的负电荷被质子化了，使得DNA与EV之间 缺乏静电力的作用，从而EV难以和DNA通过静电力作用而显色了；而在碱性环境下的 下降，由于EV与OH_发生了化学反应(图4)，其产物不再具有显色能力。根据实验结 果，优选在本专利技术的第一方面，所述染色液的pH为6-8，如pH6、pH6.5、或pH7。染色后，聚丙烯酰胺凝胶无需脱色步骤。因此，优选本专利技术第一方面所述的方 法不包括脱色步骤。染色后的聚丙烯酰胺凝胶可以倒掉染色溶液后，就直接观察染色结 果，也可以洗去其表面残留的染色液，然后用于观察结果。优选在本专利技术的第一方面， 所述方法包括在染色后洗涤的步骤。更优选本专利技术第一方面所述的方法由将聚丙烯酰胺 凝胶浸入pH为5.5-9的含乙基紫的染色液中染色的步骤和在染色后洗涤的步骤组成。在 本文中，“洗涤”指的是用溶剂清洗聚丙烯酰胺凝胶，用以洗去上一步骤残留在聚丙烯 酰胺凝胶上的试剂。其中，优选溶剂是醇、水、生理盐水或缓冲液，如Tris-HCl缓冲 液、PBS缓冲液等。洗涤的时间不必过长，可以是30秒至5分钟，优选是1分钟至3分 钟。优选洗涤是先用醇洗然后用水洗。在本专利技术的具体实施方式中，先用50%乙醇溶液 冲洗1分钟，接着用去离子水清洗1分钟。优选在本专利技术的第一方面中，所述染色液中乙基紫的浓度为0.0005 %至 0.0015%,优选为0.0006%至0.0012%，最优选为0.0008%。本专利技术人经研究发现，EV 浓度过低，则染色后的颜色强度会有下降，而浓度过高，EV会使背景也过多地染上色， 从而降低图像的对比度。另外，在本文中如未特别指出，所述“溶液”均为水溶液，艮口 溶剂为水，优选明示出其中所含的溶质为所述溶液中的全部溶质；也优选对于液体溶质 来说，其百分比浓度指的是体积百分比浓度，而对于固体溶质来说，其百分比浓度指的 是质量百分比浓度。在现有的染色方法中，有机溶剂常用来作为染色的介质或固定剂，用以提高染 色强度，从而提高灵敏度。但是，本专利技术人经研究发现，有机溶剂并不能对聚丙烯酰胺 凝上的DNA有效提高染色强度。因此出于成本和配制方便的考量，优选在本专利技术的第一 方面中，所述染色液基本不含有机溶剂。其中，“基本”表示有机溶剂的含量小于5%， 优选小于1%，更优选小于0.1%，更加优选小于0.01%，在本专利技术的具体实施方式中， 除了最初为了快速溶解EV而使用有机溶剂之外，稀释时不再添加有机溶剂。优选所述 有机溶剂选自甲醇、乙醇、甘油和丙二醇之一或多种。在现有的染色方法中，无机盐常用来降低凝胶背景上染色的程度。但是，本发 明人经研究发现，加入无机盐后随着凝胶背景上染色强度的下降，DNA条带的染色强度 更剧烈地下降。这可能是由于无机盐中的阳离子与EV竞争性地结合掉了 DNA双链上 磷酸基团所带的负电荷的缘故。因此，优选在本专利技术的第一方面中，所述染色液基本不 含无机盐。其中，“基本”表示无机盐的浓度小于5mM，优选小于ImM，更优选小于O.lmM,更加优选小于O.OlmM，在本专利技术的具体实施方式中，除了为了调节pH加入酸 或碱而可能形成的无机盐之外，不再添加无机盐。优选所述无机盐选自NaCl、MgCl2、 ZnCl2和(NH4)2SO4之一或多种。最优选，本专利技术第一方面所述的方法中所述的染色液是 EV的水溶液，其中溶质仅是EV，溶剂仅是水。在本专利技术的第一方面中，染色的时间为至少5分钟。本专利技术人研究发现，染色 的时间可以不必过长。因此出于节约操作时间的考量，优选在本专利技术的第一方面中，染 色的时间优选为10至240分钟，更优选为1本文档来自技高网...

【技术保护点】
在聚丙烯酰胺凝胶上对ＤＮＡ染色的方法，其特征在于，所述方法包括将聚丙烯酰胺凝胶浸入ｐＨ为５．５－９的含乙基紫的染色液中染色。

【技术特征摘要】
1.在聚丙烯酰胺凝胶上对DNA染色的方法，其特征在于，所述方法包括将聚丙烯酰 胺凝胶浸入pH为5.5-9的含乙基紫的染色液中染色。2.权利要求1所述的方法，其包括在染色后洗涤的步骤。3.权利要求1或2所述的方法，其中所述染色液中乙基紫的浓度为0.0005%至 0.0015%,优选为 0.0006%至 0.0012%，最优选为 0.0008%。4.权利要求1或2所述的方法，其中所述染色液基本不含有机溶剂，优选所述有机溶 剂选自甲醇、乙醇、甘油和丙二醇之一或多种。5.权利要求1或2所述的方法，其中所述染色液基本不含无机盐，优选所述无机盐选 自 NaCl、MgCl2...

【专利技术属性】
技术研发人员：金利泰，丛维涛，李校堃，梁广，冯治国，林绍强，朱忠欣，张美玲，
申请(专利权)人：温州医学院，
类型：发明
国别省市：33[中国|浙江]