一种石斑鱼白细胞介素ＥｃＩＬ－１β基因、编码的蛋白及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种石斑鱼白细胞介素ＥｃＩＬ－１β基因、编码的蛋白及其制备方法和应用。本发明专利技术石斑鱼ＥｃＩＬ－１β基因的序列如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１所示，该基因编码的蛋白序列如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３所示。本发明专利技术通过同源克隆的方法，从斜带石斑鱼中分离得到ＥｃＩＬ－１β基因，并通过将该基因转入表达载体中，经过大肠杆菌以胞内可溶的形式表达，经分离纯化后，得到的蛋白可以作为鱼类饵料的免疫调节添加剂，还可用于研发鱼类疫苗免疫佐剂。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及石斑鱼基因工程
，具体涉及一种石斑鱼白细胞介素EcIL-I β 基因、编码的蛋白及其制备方法和应用。
技术介绍
促炎症因子白细胞介素αυ- β，是启动和调控免疫反应必需的信号分子，对多 种免疫细胞的分化、生长和活化增殖有重要的调节作用。白细胞介素- β氨基酸序列的特 征是含有两个必备的保守结构，包括成熟肽所形成的一个三叶草型功能结构域，是IL-I 蛋白与其特异受体结合并引发细胞内信号通路的关键位点；其蛋白羧基端含有IL-I家族 保守的标识序列。IL-I具有广泛的生物学活性。目前已知IL-I不仅对多种免疫细胞有重要的调节 作用，如可以影响胸腺细胞的增殖，B细胞的生长和分化以及IL-2、IL-6的生成；而且它也 参与造血、骨代谢、压力反应、睡眠调节、摄食、神经内分泌及抗肿瘤等多种生理过程，并与 发热、炎症以及某些疾病如中风、阿尔茨海默氏病、唐氏综合症，以及自身免疫性疾病有关。IL-I可以促进胸腺细胞、T细胞的活化、增殖和分化。T细胞经抗原等刺激后表达 IL-I受体，在IL-I作用下活化分泌IL-2、干扰素、(IFNy)等细胞因子，并表达IL-2高亲 和力受体进而令T细胞发生增殖和分化。IL-I还可以增加T细胞表面MHC II类抗原的表 达，诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的分化。IL-I还能协同IL-4等细胞因子刺激B细胞的 增殖和分化，促进免疫球蛋白的合成和分泌。IL-I还作用于单核细胞和巨噬细胞，诱导单 核-巨噬细胞产生IL-6和肿瘤坏死因子(TNF)，并通过单核细胞和巨噬细胞产生IL-8介导 对中性粒细胞的趋化作用，刺激中性粒细胞释放炎症蛋白和介质，直接参与炎症发生过程， 抑制粒细胞凋亡，促进粒细胞黏附和迁移。与哺乳动物相似，鱼类IL-I β重组蛋白能够影响刺激免疫细胞的增殖，增加 IL-I β自身的基因表达，以及诱导下游免疫基因，如环氧化物酶-2 (C0X-2)，MHC II基因的 表达，并能够作为鱼类免疫调节剂，加速体内特异抗体的生成。重组的IL-Ιβ蛋白并可影 响鱼类的神经内分泌。初步研究的结果表明，灌流高剂量的重组鲤鱼IL-I β会引致其垂 体释放α-促黑激素和β-内啡肽。Holland等以不同剂量的重组IL-I β蛋白和脂多糖 (LPS)分别注射虹鳟，能明显检测到血浆中的皮质醇以剂量或时间效应显著提高。由于促肾 上腺皮质激素(ACTH)可促进肾上腺皮质分泌相应的皮质激素，主要以皮质醇的形式，因此 利用ACTH的抑制剂——地塞米松可阻断重组IL-I β或LPS、介导的血浆中皮质醇的升高， 这说明IL-I β和LPS调节皮质醇分泌是通过下丘脑-垂体轴来实现的。斜带石斑鱼(orange-spotted grouper, Epinephelus coioides)属倉卢形 目(Perciformes)、魚旨禾斗(Serranidae)，石斑鱼亚禾斗(Epinephelinae)，石斑鱼属 (Epinephelus)。主要分布于沿海近礁水域，是我国华南沿海一带以及东南亚地区重要的海 水养殖鱼类，肉质鲜嫩，味美，营养丰富，经济价值高。近年来，石斑鱼养殖业发展迅速，但普遍采用高密度网箱养殖，因此人工饲养鱼群的疾病易感机率大。目前在石斑鱼人工养殖中 还没有一种能有效促进疫苗产生的免疫佐剂和有效增强鱼类免疫的饲料添加剂。
技术实现思路
本专利技术的目的在于根据现有技术中存在的不足，提供一种石斑鱼白细胞介素 EcIL-I β 基因。本专利技术另一目的在于提供上述基因编码的蛋白。本专利技术再一目的在于提供上述基因编码的蛋白的制备方法。本专利技术还有一个目的在于提供上述基因编码的蛋白的应用。本专利技术上述目的通过以下技术方案予以实现一种石斑鱼白细胞介素EcIL-I β基因，其序列如SEQ ID NO :1所示，该基因是通 过同源克隆的方法从斜带石斑鱼脾脏中分离得到的。上述石斑鱼白细胞介素EcIL-I β基因所编码的蛋白，其氨基酸序列SEQ IDNO 3 所示，共邪4个氨基酸，等电点为5. 10，分子量为28. 66千道尔顿，含有一个潜在的N-糖基 化位点Asn8和一个位于羧基端的IL-I家族表示序列(L) -M- (SV) -AH- (P) -NW- (YIST) -AEA DNMP-(V)(中括号表示保守氨基酸)。本专利技术石斑鱼白细胞介素EcIL-I β基因所编码的蛋白可以通过表达载体在大肠 杆菌中以胞内可溶的形式表达。具体制备方法包括如下步骤(1)将权利要求1所述的石斑鱼白细胞介素EcIL-Ιβ基因克隆至大肠杆菌表达载 体pET22b上，得到重组表达质粒；(2)将该重组表达质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3)；(3)对转化的大肠杆菌进行培养；(4)经纯化，得到石斑鱼白细胞介素EcIL-I β基因编码的蛋白。其中，步骤(1)中，所述重组表达质粒的构建包括以下步骤根据石斑鱼白细胞介 素EcIL-I β基因的两端序列合成一对引物，上游引物含如SEQ ID NO :4所示，含Nde I酶切 位点，下游引物如SEQ ID NO :5所示，含Not I酶切位点；以含石斑鱼白细胞介素EcIL-I β 基因全长的PGEM-T fesy载体质粒为模板，利用上述引物进行PCR扩增；将PCR扩增产物克 隆到原核融合表达载体pET22b上，得到重组表达质粒，该表达质粒含有6XHis亲和标记位 点。该表达质粒是以T7为启动子，获得的蛋白的C端有6XHis结构，便于利用固定化金属 配体亲和层析进行纯化。步骤C3)中，所述培养是将转化的大肠杆菌单菌落接种至含氨苄青霉素LB加富液 体培养基中培养过夜；再按1 50体积比接种到37°C预热的含氨苄青霉素LB加富液体培 养基中培养至0D600达0. 6 ；加入IPTG至终浓度为0. 5mmol/L,经诱导后收集菌体。作为一种优选方案，所述用含氨苄青霉素LB加富液体培养基进行培养的条件是 30°C,250rpmo步骤(4)中，所述纯化的方法是将总菌体用PB缓冲液洗涤，再用结合缓冲液重悬， 超声处理后，高速离心获得裂解上清液，经固定化金属配体亲和层析纯化，收集洗脱的蛋 白。作为一种优选方案，所述PB缓冲液的浓度为50mmol/L，pH = 6. 8，所述结合缓冲液是 pH = 7. 4 的，含 20mmol/L PB、500mmol/L NaCl 和 10mmol/L 咪唑的混合溶液。通过对培养时间、诱导时间和温度等条件的摸索和优化，使得到的融合蛋白的表 达量较高，大部分处于可溶状态；还优化了重组蛋白的纯化条件，表达产物的超声裂解液经 固定化金属配体亲和层析，得到的蛋白纯度在90%以上。本专利技术蛋白可用于制备鱼类饵料的免疫调节添加剂或鱼类疫苗免疫佐剂。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果本专利技术通过近源物种IL-I β基因⑶S序列保守区设计了简并引物，通过PCR扩增 得到EcIL-I β基因，并构建表达载体，转化到大肠杆菌中培养，可大量表达石斑鱼白细胞 介素EcIL-Ιβ基因所编码的蛋白。本专利技术石斑鱼白细胞介素EcIL-I β基因所编码的蛋白 能有效促进疫苗产生的免疫佐剂，还可作为增强鱼类免疫的饵料添加剂。附图说明图1是本专利技术石斑鱼白细胞介素EcIL-Ιβ基因编码的蛋白与部分脊椎动物 IL-I本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种石斑鱼白细胞介素ＥｃＩＬ－１β基因，其序列如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１所示。

【技术特征摘要】
1.一种石斑鱼白细胞介素EcIL-I β基因，其序列如SEQ ID Ν0:1所示。2.权利要求1所述石斑鱼白细胞介素EcIL-Iβ基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO 3所示，等电点为5. 10，分子量为28. 66千道尔顿。3.权利要求2所述石斑鱼白细胞介素EcIL-Iβ基因编码的蛋白的制备方法，其特征在 于包括以下步骤(1)将权利要求1所述的石斑鱼白细胞介素EcIL-Iβ基因克隆至大肠杆菌表达载体 pET22b上，得到重组表达质粒；(2)将该重组表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)；(3)对转化的大肠杆菌进行培养；(4)经纯化，得到石斑鱼白细胞介素EcIL-Iβ基因编码的蛋白。4.根据权利要求3所述石斑鱼白细胞介素EcIL-Ιβ基因编码的蛋白的制备方法， 其特征在于步骤(1)中，所述重组表达质粒的构建包括以下步骤根据石斑鱼白细胞介素 EcIL-I β基因的两端序列合成一对引物，上游引物含如SEQ IDNO 4所示，下游引物如SEQ ID NO :5所示；以含石斑鱼白细胞介素EcIL-I β基因全长的pGEM-T fesy载体质粒为模板， 利用上述引物进行PCR扩增；将PCR扩增产物克隆到原核融合表达载体pET22b上，得到重 组表达质粒，该质粒含有6 XHis亲和标记位点。5.根据权利要求4所述石斑鱼白细胞介素EcIL-Iβ基因编码的蛋白的制备方法，其特 征在于所述上游引物含Nde ...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢丹琪，姚谧，张旭，贝锦新，冯丽娜，冷婷婷，林浩然，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]