本发明专利技术公开了一种利用金属氧化物富集糖肽以及同时富集糖肽和磷酸化肽的方法。本方法特点在于利用金属氧化物做为固相萃取材料，从蛋白酶解液中分离富集糖肽，并且利用简单的操作可以从一份样品中实现磷酸化肽和糖肽的同时富集。具体地说是在中性或弱酸性条件下将金属氧化物和样品混合，酸性条件洗脱得到糖肽，碱性条件洗脱得到磷酸化肽，可以在同一份样品中实现磷酸化肽和糖肽的高效率、高选择性的富集。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及糖肽和磷酸化肽的分离与纯化，具体地说是一种利用金属氧化物富集 糖肽以及同时富集磷酸化肽和糖基化肽的方法。
技术介绍
翻译后蛋白质的修饰是蛋白质组学中的研究热点课题，尤其是蛋白质的磷酸化和 糖基化，是存在最为普遍，研究最为广泛的两种翻译后修饰过程。蛋白质的磷酸化几乎调控 生命的整个过程，包括细胞的增殖，发育和分化，也是目前所知道的信号的主要传递方式之 一。同时，了解蛋白质的糖基化过程，对一些如癌症炎症等疾病的诊断和治疗都是具有非常 重要的意义。目前，对于蛋白质翻译后修饰过程的研究一个非常重要的手段就是利用生物 质谱解析蛋白质的肽段结构，但由于糖基化和磷酸化肽段离子化效率较低，质谱信号常常 受到非修饰肽段的抑制，严重干扰对修饰肽段的检测。因此，在质谱分析前对磷酸化和糖基 化肽段的富集是非常必要的[Liu, X. ；Ma, L. ；Li, J. J. Anal. Lett. 2008,41,268 ；Morelle, W. ；Canis, K. ；Chirat, F. ；Faid, V. ；Michalski, J.C. Proteomics 2006,6,3993]。近年来，很多富集糖肽的方法被提出和应用。最为常见的就是凝集素的方法，这种 方法的选择性较好，但同时存在着通用性不强的缺点，尤其在处理复杂样品时很可能会丢 失不能与凝集素特异性结合的糖肽[J. Glycoconjugate J. 2004,21,35 ；Kubota, K. ；Sato, Y. ；Suzuki, Y. et al. Anal :Chem. 2008，80，3693]；化学方法如胼化学可以选择性的富集糖 肽，但是这种方法丢失糖链的信息[Zhang, H. ；Li, X. J. ；Mart in, D. B. ；Aebersold, R. Nat. Biotechnol. 2003，21，660.]；亲水作用色谱也能够用来富集极性相对较大的糖肽，但是容 易受到具有相当极性的非糖肽的干扰[Wada, Y. ；Tajiri，M. ；Yoshida, S. Anal. Chem. 2004， 76,6560.]；硼酸能与顺势二醇形成硼酸酯结构也可以用来绑定糖肽，但这种方法的费时较 长[Zhou，W. ；Yao, N. ；Yao, G. P. ；Deng，C. H. ；Zhang，Χ. Μ. ；Yang，P. Y. Chem. Commun. 2008， 5577.]；石墨化碳与极性的糖肽发生偶极相互作用而加强对糖肽的保留，但是不适用于具 有较长肽段的糖肽。总之。目前还未见一种操作简单通用性强的富集方法来选择性的富集 糖肽。用金属氧化物作为富集材料对糖肽进行富集目前未见报道。相较于糖肽的富集磷酸化肽的富集近年来发展迅速，以氧化钛为代表的金属氧 化物，在磷酸化肽富集方面展现了其选择性高特异性好的特点[Pinkse，M.W.H. ；Uitto, P. M. ；Hilhorst, M. J. ；Ooms, B. ；Heck, A. J. R. Anal. Chem. 2004, 76, 3935 ；Larsen, Μ. R.； Thingholm, Τ. Ε. ；Jensen, 0. N. ；Roepstorff, P. ；Jorgensen, Τ. J. D. Mol. Cell. Proteomics 2005，4，873.]，已经被广泛的应用到磷酸化蛋白质组学中。但是，用金属氧化物在一次操作 中同时得到糖肽和磷酸化肽还未见报道。
技术实现思路
为解决上述难点，专利技术人通过研究氧化钛微球对单糖和寡糖的色谱保留行为发 现，糖在氧化钛色谱柱上有很强的保留，这种保留随糖链的增长而增强，随流动相酸性添加4剂的浓度增加而减少。专利技术人将氧化钛微球的这个性质用于进行糖肽的富集，通过对结构 明确的标准糖蛋白的酶解液在不同条件下洗脱糖肽和非糖肽，实现了对糖肽的选择性富 集。同时，由于氧化钛可以同时保留糖肽和磷酸化肽，通过在酸性条件下洗脱糖肽，在碱性 条件下洗脱磷酸化肽，实现了糖肽和磷酸化肽的同时富集。，以金属氧化物作为固 相萃取材料，富集蛋白酶解物中的糖肽或同时富集磷酸化肽和糖肽。所述金属氧化物为氧化钛、氧化锆、氧化铝中的一种或多种复合金属氧化物；金属 氧化物材料形态为纳米材料、微球材料以及金属氧化物涂覆或包覆的球形或无定形材料。所述富集的过程为柱萃取，具体操作如下1)将金属氧化物装入萃取柱管中，将PH为5-8蛋白酶解物上样到萃取柱中，蛋白 酶解物与金属氧化物材料的重量比例为1 1 200;2)分别用1 10倍柱体积的盐溶液、1 10倍柱体积的含有有机酸的乙腈水溶 液冲洗萃取柱，乙腈的体积浓度为0-95% ；；3)采用1 10倍柱体积的含有有机酸的乙腈水溶液洗脱糖肽，乙腈的体积浓度为 0-95% ；4)采用1 10倍的柱体积的0. 5-25wt%氨水洗脱得到磷酸化肽。所述富集的过程为离心或过滤，具体操作如下1)将金属氧化物与pH为5-8的蛋白酶解物混合，蛋白酶解液中内含的蛋白酶解物 与金属氧化物材料的重量比例为1 1 200，孵化1 180分钟，离心或过滤分离，弃上层 溶液，收集沉淀；2)将2-100倍固体体积的盐溶液、2-100倍固体体积的含有有机酸的乙腈水溶液 分别与沉淀混合震荡1 180分钟，乙腈的体积浓度为0-95%，离心或过滤分离，弃上层溶 液，收集沉淀；此过程重复1-10次；3)将1-50倍固体体积的含有有机酸的乙腈水溶液与沉淀混合震荡1 180分钟， 乙腈的体积浓度为0-95%，离心或过滤分离，收集上清液以及沉淀，上清液即为糖肽；4)将0. 5-25wt%氨水与沉淀混合震荡1 180分钟，离心或过滤分离，收集上清 液，弃去沉淀，上清液即为磷酸化肽。所述富集的过程采用金属氧化物包覆磁珠进行，具体操作如下1)将pH为5-8磁珠与蛋白酶解物混合，蛋白酶解液中内含的蛋白酶解物与磁珠材 料的重量比例为1 1 200，孵化1 180分钟，在磁场作用下分离磁珠和上清液，弃上层 溶液，收集磁珠；2)将2-100倍固体体积的盐溶液、2-100倍固体体积的含有有机酸的乙腈水溶液 分别与磁珠混合震荡1 180分钟，乙腈的体积浓度为0-95%，在磁场作用下分离磁珠和上 清液，弃上层溶液，收集磁珠，此过程重复1-10次；3)将1-50倍固体体积的含有有机酸的乙腈水溶液与磁珠混合震荡1 180分钟， 乙腈的体积浓度为0-95%，在磁场作用下分离磁珠和上清液，收集上清液以及磁珠，上清液 即为糖肽；4)将1-50倍固体体积的0. 5_25wt %氨水与磁珠混合震荡1 180分钟，在磁场 作用下离心磁珠和上清液，收集上清液，磁珠可以再利用，清液即为磷酸化肽。所述盐溶液为10 lOOOmmol/L氯化钠、磷酸盐、碳酸盐中一种或多种；有机酸为 甲酸、乙酸或三氟乙酸；所述步骤幻中的有机酸溶液体积浓度为0 10%;步骤幻中的有 机酸溶液体积浓度为0. 01 20%。本专利技术具有如下优点1.本专利技术将金属氧化物引入到糖肽富集的领域，通过氧化物表面的亲水性质实现 了糖肽的选择性富集。氧化钛对糖肽的这种亲和性是针对糖肽中的糖链的，所以具有很强 的普适性和很高的特异性。2.本文档来自技高网...
【技术保护点】
用金属氧化物富集糖肽及同时富集糖肽和磷酸化肽的方法，其特征在于：以金属氧化物作为固相萃取材料，富集蛋白酶解物中的糖肽或同时富集磷酸化肽和糖肽。
【技术特征摘要】
1.用金属氧化物富集糖肽及同时富集糖肽和磷酸化肽的方法，其特征在于以金属氧 化物作为固相萃取材料，富集蛋白酶解物中的糖肽或同时富集磷酸化肽和糖肽。2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述金属氧化物为氧化钛、氧化锆、氧化 铝中的一种或多种复合金属氧化物。3.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述金属氧化物材料形态为纳米材 料、微球材料以及金属氧化物涂覆或包覆的球形或无定形材料。4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述富集的过程为柱萃取，具体操作如下1)将金属氧化物装入萃取柱管中，将PH为5-8蛋白酶解物上样到萃取柱中，蛋白酶解 物与金属氧化物材料的重量比例为1 1 200 ；2)分别用1 10倍柱体积的盐溶液、1 10倍柱体积的含有有机酸的乙腈水溶液冲 洗萃取柱，乙腈的体积浓度为0-95% ；3)采用1 10倍柱体积的含有有机酸的乙腈水溶液洗脱糖肽，乙腈的体积浓度为 0-95% ；4)采用1 10倍的柱体积的0.5-25wt%氨水洗脱得到磷酸化肽。5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述富集的过程为离心或过滤，具体操作 如下1)将金属氧化物与PH为5-8的蛋白酶解物混合，蛋白酶解液中内含的蛋白酶解物与 金属氧化物材料的重量比例为1 1 200，孵化1 180分钟，离心或过滤分离，弃上层溶 液，收集沉淀；2)将2-100倍固体体积的盐溶液、2-100倍固体体积的含有有机酸的乙腈水溶液分别 与沉淀混合震荡1 180分钟，乙腈的体积浓度为0-95%，离心或过滤分离，弃上层溶液，收 集沉淀；此过程重复1-10次；3)将1-50倍固体体积的含有有机酸的...
【专利技术属性】
技术研发人员：梁鑫淼，闫竞宇，柯燕雄，李秀玲，张秀莉，薛兴亚，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：91
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