在疑为包含存活微生物的样品中检测和计数所述微生物的方法：（１）将所述样品的所述微生物与至少一种修复化合物和生长培养基接触，和（２）培养步骤（１）的产物，和（３）检测和定量所述存活微生物，其中微生物物种为嗜肺军团杆菌，其中修复化合物直接或间接影响代谢以降低微生物的氧化应激。本发明专利技术还包含试剂盒，用于更准确检测和计数疑为包含所述微生物的样品中的嗜肺军团杆菌存活微生物。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】微生物检测和计数本专利技术涉及检测和计数样品中物种嗜肺军团杆菌(Legionellapneumophila)存 活微生物的方法。本专利技术也包括适用于此方法的试剂盒。此方法和试剂盒使存活微生物的 定量更快速。军团杆菌(Legionella)细菌在潮湿或湿润环境例如土壤和非海水生生境中普遍 存在。也可以在温水和冷水设施、空调系统的冷却塔和加湿器中找到它们。军团杆菌特别是嗜肺军团杆菌是病原体，可引起急性细菌性肺炎，通常称为“军团 病”，在感染的个体中经常是致命的。嗜肺军团杆菌的传统检测和计数是通过细胞培养进行。此方法可使用平板计数通 过测量可培养的细菌进行，或应用滤过膜方法测量微菌落进行。这些技术通过存活细菌形 成菌落或微菌落的能力评估存活细菌。不幸的是，这些方法通常需要3至10天以形成菌落 或微菌落。当用水装置仍然在运行时，在这期间存在感染人的不可接受的风险。检测总军团杆菌微生物的其他方法包括PCR(聚合酶链式反应)技术。PCR应用 DNA聚合酶通过体外酶促复制扩增一段DNA。在技术进行中，生成的DNA作为复制的模板使 用从而导致DNA模板指数扩增的链式反应。PCR通过生成百万或更多拷贝的DNA段使单个 或较少拷贝的一段DNA扩增。一般的这些方法在Diederen等人，J Med Microbiol. 2007 Jan ；56 (Ptl) :94_101 中描述。然而PCR的一个缺点是样品容易包含聚合反应抑制剂，因此不能一致的提供量化 结果。此外，该技术依赖于之前的DNA纯化步骤，所述步骤可导致DNA的损失从而导致低估 存在的军团杆菌。在一定程度上定量实时PCR克服了这些缺点。然而，该技术不能区分存 活细胞和非存活细胞。另一个技术是荧光原位杂交(FISH)，其中荧光物质标记的寡核苷酸探针渗入细 菌细胞。其中核糖体核酸(rRNA)具有针对探针的正确序列即靶标，探针将与其靶标吸 附，并且在任意后续清洗步骤中不被去除。固定了探针的细菌之后将发射荧光信号。此 荧光信号可通过例如流式细胞术、固相细胞术或表面荧光显微镜技术(epifluorescent microscopy)定量。一般的 FISH 技术在 Dutil S et al J Appl Microbiol. 2006May ； 100(5) :955-63中描述。然而，单独使用FISH技术可检测存活的嗜肺军团杆菌总数，但不 幸的是该方法无法专门鉴定能够分裂并从而形成菌落的嗜肺军团杆菌细菌。计数存活嗜肺军团杆菌的另一个方法涉及ChemChrome V6,在 Delgado-Viscogliosi 等，Appl Environ Microbiol. 2005Jul ；71 (7) :4086_96 中描述。此 方法允许量化嗜肺军团杆菌，并能够区分存活和非存活细菌。此方法结合了用抗体和细菌 存活标记(ChemChrome V6)特异性检测军团杆菌细胞和应用表面荧光显微镜术计数。然而， 尽管此技术可区分存活和非存活细胞，但不能单独鉴定那些形成菌落的细菌。US 20070218522描述了检测和定量存活军团杆菌和其他异养需氧细菌的方法和 组合物，所述方法包括使用包括吸收性培养基、生长促进和生长选择性物质的蘸片快速检 测和定量军团杆菌微菌落。此技术不能计数损伤的细菌。EP 1329515涉及检测包含过氧化氢的气态环境中微生物存在的方法，通过将气态环境与包含丙酮酸盐的琼脂生长培养基接触，允许微生物菌落的发展。一般认为涉及在生长培养基例如营养琼脂板上生长菌落的技术更准确。因此平板 计数方法仍然是获得总活菌数的优选方法。这一般表示将疑为包含微生物的样品应用于包 含固体营养来源或生长培养基的平板上。这一技术一般称为平板接种。提及总活菌数，我 们的意思是能够产生观察者可识别群体的细菌总数。一般的这表示在生长培养基例如营养 琼脂板表面的可见菌落。然而，环境中的微生物例如嗜肺军团杆菌可能经受一种或多种阻碍微生物在其环 境条件下生长和繁殖的胁迫。这些受胁迫的微生物在常规培养条件下完全不会分裂或不形 成可见菌落。在环境中一部分微生物细胞一般会承受由于环境条件例如饥饿、杀生物剂的 存在、热休克和干燥的压力。此外，这些细胞可能处于脆弱的生理状态，平板接种微生物技 术可能加重已经受胁迫的微生物的胁迫，原因是大气中氧气的存在。此外这可能导致受胁 迫细菌的人为死亡，从而导致总活菌数的低估。此外，由于其致病性，平板接种方法导致的存活嗜肺军团杆菌的低估可能是危险 的。由于在20世纪70年代已有报导，应当使用活性氧族(ROS)的清除剂限制在平 板接种过程中的氧化应激效应。这在Speck等人，impair andenumeration of injured coliforms by a plating procedure, ApplMicrobiol 29,549-50 (1975) ；Martin 等 人 Catalase :its effect onmicrobial enumeration. Appl Environ Microbiol 32, 731-4(1976) ；Brewer 等 人 Beneficial effects of catalase or pyruvate in amost-probable-number technique for the detection of Staphylococcusaureus. Appl Environ Microbiol 34,797-800 (1977) ；McDonald 等 人’ Enhanced recovery of injured Escherichia coli by compounds thatdegrade hydrogen peroxide or block its formation. Appl EnvironMicrobiol 45,360-5 (1983) ；Marthi 等 人 Resuscitation effects ofcatalase on airborne bacteria. Appl Environ Microbiol 57,2775-6 (1991) ；Busch 禾口 Donnelly Development of a repair-enrichment brothfor resuscitation of heat-injured Listeria monocytogenes andListeria innocua. Appl Environ Microbiol 58,14-20(1992)；禾口 Dukan 等人，Oxidative stress defense and deterioration of growth-arrestedEscherichia coli cells. J Biol Chem 274, 26027-32(1999)中报导。然而，在所有上述情况下本专利技术的专利技术者相信ROS可通过直接途径降低，其中化 合物与ROS发生化学反应。Berube 等 人， ” Rapid detection and identification ofLegionella pneumophil本文档来自技高网...
【技术保护点】
在疑为包含存活微生物的样品中检测和计数所述微生物的方法： （１）将所述样品的所述微生物与至少一种修复化合物和生长培养基接触，和 （２）培养步骤（１）的产物，和 （３）检测和定量所述存活微生物， 其中微生物物种为嗜肺军团杆菌，其中修复化合物直接或间接影响代谢以降低微生物的氧化应激。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：Y弗维，A杜克雷，S迪康，
申请(专利权)人：巴斯夫欧洲公司，科学研究国家中心，
类型：发明
国别省市：DE[德国]
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