流感病毒疫苗抗原制备方法的改进技术

公开了从裂解的流感病毒制备疫苗抗原的许多改进。裂解步骤之后可以是去污剂交换。裂解可在存在较高离子强度的缓冲液和／或存在磷酸盐缓冲液时进行。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及流感疫苗制备领域。
技术介绍
参考文献1的第17和18章描述了目前常规使用的流感疫苗。它们基于活病毒或 灭活病毒，灭活疫苗可以基于完整病毒、‘裂解'病毒或纯化的表面抗原(包括血凝素以 及也是通常使用的神经氨酸酶)。已知有许多不同的制备裂解抗原疫苗和表面抗原疫苗的方法。例如，各种裂解过 程如参考文献2-8所述，而制备表面抗原疫苗的不同方法披露于参考文献9-14。本专利技术的目的是提供制造裂解疫苗和表面抗原疫苗的改良方法。
技术实现思路
专利技术人曾经对现有的从裂解的流感病毒制备疫苗抗原的方法设计了许多改进。去污剂使用时间的改进在现有纯化方法中，流感病毒颗粒先接触第一去污剂(例如聚山梨酸酯，如聚山 梨酸酯80)，然后用第二去污剂(例如CTAB)裂解。第一去污剂在病毒灭活之前使用，而第 二去污剂在灭活之后加入。在上述方法中，第二去污剂随后除去，而第一去污剂仍旧保留， 从而有助于抗原溶解。相反，根据本专利技术的第一个方面，第一去污剂较晚使用，具体地说是在已经用第二 去污剂裂解病毒颗粒之后。这种时间和顺序的变化使得抗原产量提高了 20倍以上，尤其是 对于H5亚型的甲型流感病毒。因此，本专利技术提供了一种分裂流感病毒颗粒的方法，所述方法包括以下步骤(i) 在不存在去污剂时获得包含流感病毒颗粒的组合物；(ii)在不存在去污剂时灭活所述流 感病毒颗粒；(iii)用包含第一去污剂的试剂裂解灭活的病毒颗粒；和(iv)用第二去污剂 交换第一去污剂。所述去污剂交换步骤可在裂解步骤之后的任何时刻进行，但在病毒颗粒 捕获步骤之前进行较为理想，所述捕获步骤可通过以下方法进行，例如，亲和捕获、伪亲和 捕获、层析或吸附(见下文)。因此，第二去污剂可在裂解之后但在病毒颗粒捕获之前加入。 可在病毒颗粒捕获之后再加入额外量的第二去污剂，尤其是如果之前加入的第二去污剂的 量小于1.5g/L时。通过这种方法获得的分裂的病毒颗粒可用于制备流感疫苗。本专利技术还提供了一种分裂流感病毒颗粒的方法，改进之处在于在不存在去污剂 时灭活流感病毒颗粒；用包含第一去污剂的试剂裂解灭活的病毒颗粒；以及在裂解后用第 二去污剂交换第一去污剂。3在第一方面的其它实施方式中，所述第二去污剂是在灭活之后但在裂解之前加入 的。因此，本专利技术提供了一种分裂流感病毒颗粒的方法，所述方法包括以下步骤(i)在不 存在去污剂时获得包含流感病毒颗粒的组合物；(ii)在不存在去污剂时灭活所述流感病 毒颗粒；(iii)加入第二去污剂但不裂解灭活的病毒颗粒；(iv)在存在第二去污剂时用包 含第一去污剂的试剂裂解灭活的病毒颗粒；和(ν)除去第一去污剂同时保留第二去污剂。通过这种方法获得的分裂的病毒颗粒可用于制备流感疫苗。本专利技术还提供了一种分裂流感病毒颗粒的方法，改进之处在于在不存在去污剂 时灭活所述流感病毒颗粒；在存在第二去污剂时用包含第一去污剂的试剂裂解灭活的病毒 颗粒；以及在裂解之后除去第一去污剂同时保留第二去污剂。在改进去污剂使用时间的还有其它实施方式中，去污剂是在病毒颗粒灭活之前、 但在对病毒颗粒进行超滤/渗滤步骤之后加入的。因此，本专利技术提供了一种分裂流感病毒 颗粒的方法，所述方法包括以下步骤(i)在不存在去污剂时获得包含流感病毒颗粒的组 合物；( )对含有病毒颗粒的组合物进行超滤/渗滤；(iii)在滤过的含有病毒颗粒的组 合物中加入去污剂但不裂解病毒颗粒；和(iv)灭活流感病毒颗粒。该方法还可包括步骤 (ν)用去污剂裂解灭活的病毒颗粒。步骤(ν)中使用的去污剂可以不同于步骤(iii)中使 用的去污剂。可在步骤(ν)之后加入额外量的与步骤(iii)中所用相同的去污剂，尤其是 如果步骤(iii)中去污剂的加入量小于1. 5g/L时。在之前去污剂的加入量小于1. 5g/L时再加入额外量的去污剂的实施方式中，额 外的加入可在进一步超滤/渗滤步骤之前进行。裂解过程的改进流感疫苗的裂解过程涉及用增溶浓度的去污剂处理病毒颗粒。合适的去污剂包括 聚山梨酸酯类(吐温类)、曲通X-100、溴化十六烷基三甲基铵(CTAB) 和脱氧胆酸盐。在现有纯化过程中，在存在20mM Tris/HCl时接触去污剂而裂解流感病毒颗粒。相 反，根据本专利技术的第二个方面，在存在具有较高离子强度缓冲液时使用去污剂。因此，本发 明提供了一种分裂流感病毒颗粒的方法，所述方法包括以下步骤(i)获得包含流感病毒 颗粒的组合物；(ii)通过接触用离子强度为IOOmM或更高的缓冲液剂配制的去污剂来裂解 所述病毒颗粒。这种升高的离子强度使得抗原产量提高了 20倍以上，尤其是对于H5亚型 的甲型流感病毒。通过这种方法获得的分裂的病毒颗粒可用于制备流感疫苗。有用的缓冲液的离子强度至少为100mM,例如≥200mM、≥300mM、≥400mM、 ≥500mM、≥600mM、≥700mM、≥800mM,等等。可通过各种途径获得这种较高的离子强度， 例如使用单价离子(如NaCl)、二价离子(如硫酸盐)、三价离子(如磷酸盐)，等等。使用 三价离子是提高离子强度的便捷方法。一种适用的缓冲液，尤其是当用于基于CTAB的裂解 过程时，是用50mM磷酸盐缓冲液，pH 7.5配制的200福NaCl。在裂解过程中升高离子强度 时需要小心，尤其对于细胞培养物中生长的病毒，以免造成在随后的处理步骤中需要保留 的DNA大量溶解。本专利技术还提供了一种分裂流感病毒颗粒的方法，改进之处在于用离子强度为 100mM或更高的缓冲液剂配制的去污剂来裂解病毒颗粒。磷酸盐缓冲液在现有纯化过程中，在用Tris缓冲液裂解之前、之间和之后保持流感病毒颗粒。 相反，根据本专利技术的第三个方面，在用磷酸盐缓冲液裂解之前、之间和之后保持流感病毒颗 粒。这种缓冲液变化使得抗原产量提高了 20倍以上，尤其是对于H5亚型的甲型流感病毒。因此，本专利技术提供了一种分裂流感病毒颗粒的方法，所述方法包括以下步骤(i) 在存在磷酸盐缓冲液时获得包含流感病毒颗粒的组合物；(ii)在存在磷酸盐缓冲液时灭 活所述流感病毒颗粒；和(iii)在存在磷酸盐缓冲液时裂解所述灭活的流感病毒颗粒。通过这种方法获得的分裂的病毒颗粒可用于制备流感疫苗。有用的磷酸盐缓冲液 的PH值在6. 5和8. 5之间，例如在7. 0和8. 0之间，或者约7. 5。本专利技术还提供了一种分裂流感病毒颗粒的方法，改进之处在于灭活和随后的裂 解病毒颗粒都在存在磷酸盐缓冲液时进行。超滤膜在现有纯化工艺中，半纯化的裂解后流感病毒表面抗原用聚苯醚砜(PES)膜超滤 /渗滤进一步纯化。相反，根据本专利技术的第四个方面，超滤采用的是纤维素膜。这种膜的变 化降低了疏水性和蛋白质保留，使得抗原产量提高了 20倍以上，尤其是对于H5亚型的甲型 流感病毒。因此，本专利技术提供了一种从包含流感病毒表面糖蛋白的混合物中纯化所述糖蛋白 的方法，包括用纤维素膜超滤所述混合物的步骤。通过这种方法获得的纯化糖蛋白可用于 制备流感疫苗。本专利技术还提供了一种通过超滤从包含流感病毒表面糖蛋白的混合物中纯化所述 糖蛋白的方法，改进之处包括采用纤维素超滤膜。可使用各种类型的纤维素膜。这些膜可基于纤维素本身、纤维素酯(例如二乙酸 酯、三乙酸酯、硝酸酯，等等)或其混合物。例如，参考文献18披露了具有非纤维性聚合微孔 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分裂流感病毒颗粒的方法，所述方法包括以下步骤：（ｉ）在不存在去污剂时获得包含流感病毒颗粒的组合物；（ｉｉ）在不存在去污剂时灭活所述流感病毒颗粒；（ｉｉｉ）用包含第一去污剂的试剂裂解灭活的病毒颗粒；和（ｉｖ）用第二去污剂交换第一去污剂。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：C豪斯曼，F豪斯希尔德，B乔布斯特，
申请(专利权)人：诺华有限公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]