ＬＸＲ配体结合结构域（ＬＸＲ　ＬＢＤ）晶体制造技术

本发明专利技术涉及肝脏Ｘ受体β配体结合结构域（ＬＸＲβ－ＬＢＤ）和激动剂的共晶体，以及其衍生的三维Ｘ射线晶体结构。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】LXR配体结合结构域(LXR LBD)晶体本专利技术涉及肝脏X受体β配体结合结构域(LXRii-LBD)和激动剂的共晶体，以及 其衍生的三维X射线晶体结构。肝脏X受体(LXR)是细胞核受体超家族的成员。这些转录因子通过与特定DNA响 应元件和转录辅调节因子的复杂的系列相互作用而调节靶基因。配体的结合对这些相互作 用具有深远的影响，能触发基因激活以及在某些情况下的基因沉默。人体中共有约50种序 列相关的核受体，该家族包括识别激素(留类和非留类激素)的受体，以及对代谢中间体和 外源性化学物质响应的受体。还有许多所谓的孤儿受体，其天然配体是未知的。某些受体 显示很高的特异性和高亲和性的配体结合，如甲状腺激素受体，而其他受体具有基本上较 低的配体亲和性，在配体选择性方面同样是高度混杂的。像许多其他非留体激素受体一样， LXR作为与9-顺式-视黄酸受体(RXR)的异源二聚体来调节基因表达。LXR与过氧化物酶 体增殖物激活受体(PPAR)和法尼醇X受体(FXR) —起，代表了一类所谓允许的RXR异二聚 体的亚类。在该亚类中 ，RXR异二聚体可独立地通过RXR的配体、配对伙伴的配体或二者的 协同作用激活。LXR包括两种密切相关的受体亚型，其分别由基因LXRa (NR1H3)和LXRi^ (NR1H2) 编码。正如预期一样，最大的序列差异位于N末端结构域和连接DNA结合结构域(DBD)和 配体结合结构域(LBD)的所谓铰链区域内。LXRii显示组织限制性的表达，在肝脏中检测到 的mRNA水平最高，在肾脏、小肠、脾脏和肾上腺中的表达程度较低。反之，LXRii普遍表达。 已发现体内形成的特异性氧化固醇能激活两种LXR亚型。通过LXR缺陷的小鼠研究获得了 LXR生物学的重要发现，LXR^和LXRii敲除的小鼠均已被描述。用高胆固醇饮食刺激时， 无LXRii的种系表现出显著的代谢障碍，并且排泄过量的胆固醇。其解释是对于过量的胆 固醇，无法上调将胆固醇转化为胆汁酸的限速酶，即胆固醇7 a -羟化酶(CYP7A)。结果，通 常发生胆固醇向胆汁酸的转化被截断，肝脏中的胆固醇酯沉积，最终导致肝衰竭。相反，敲 除LXRii的种系维持了其对于高胆固醇饮食的天然抗性。这些重要发现不仅证明了 LXRii 在啮齿类动物胆固醇代谢中的重要功能，还表明LXR依赖性的CYP7A调节是具有LXR亚型 选择性的。CYP7ALXR响应元件在啮齿类动物和人类间不具有良好的保守性。因此不认为 LXR是人类的胆固醇_胆汁酸转化的主要调节因子。该观点得到在体外使用培养的人细胞 的结果的支持。然而，最近显示LXR还调节某些与胆固醇和脂质平衡有关的其他基因。主 要的例子有磷脂/胆固醇酯转运蛋白ABCA1、ABCGl和SREBPlc基因，后者诱导脂肪酸合成 酶类。对LXR参与胆固醇和脂肪酸平衡的逐渐认识，使人们产生了将LXR作为药物开发靶 点的很大兴趣。因此，需要提供能重复结晶的LXRi3-LBD共晶体形式，以进行随后的X射线晶体学 分析和基于结构的药物设计。在第一方面，本专利技术提供了肝脏X受体β配体结合结构域(LXRii-LBD)与配体的 共晶体，其中所述晶体属于空间群Ρ43。在一个优选的实施方案中，所述晶体具有下列晶胞参数a = b = 58士4人，c = 181 士4 人，α = β = γ = 90° 士3°，优选 士2°，更优选 士 1°，最优选 α = β = γ=90°。在另一个优选的实施方案中，所述配体是2- (4- {-乙基-氨基}-苯基)-1，1，1，3，3，3_六氟-丙-2-醇。在第二方面，本专利技术提供了肝脏X受体β配体结合结构域(LXRii-LBD)与配体的 共晶体，其中所述晶体属于空间群Ρ4Α2。在一个优选的实施方案中，所述晶体具有下列晶胞参数a = b = 92士4人，c = 273士4人，α = β = γ = 90°，优选士2°，更优选士 1°，最优选 α = β = γ = 90°。 在另一个优选的实施方案中，所述配体是1，1，1，3，3，3_六氟-2-{2-甲 基-1- -IH-吲哚-5-基}-丙-2-醇。在第三方面，本专利技术提供了肝脏X受体β配体结合结构域(LXRii-LBD)与配体的 共晶体，其中所述晶体属于空间群Pl。在一个优选的实施方案中，所述晶体具有下列晶胞参数a = 47 士 4人，b = 98士4 A,c = 114士4 Α，α = 74° 士3°，β = 98° 士3°，γ = 79° 士3°，优选士2°， 更优选 士 1°，最优选 α = 74°，β = 98°，Y = 79°。在另一个优选的实施方案中，所述配体是(R，S)-苯磺酰基-(6-氯-2，3，4，9-四 氢-IH-咔唑-2-基)-氟代-乙酸甲酯。在本专利技术共晶体另一个优选的实施方案中，所述LXRi3-LBD多肽是包含具有与 Seq. Id. No. 1多肽的配体结合结构域至少80%、优选至少85%、更优选至少90%、甚至更优 选至少95%、最优选100%相似度的序列的多肽。在另一个优选的实施方案中，所述LXRi3-LBD多肽包含Seq. Id. No. 1的氨基酸 213-461。在第四方面，本专利技术提供了将LXRii-LBD多肽和与所述多肽的配体结合位点结合 的化合物共结晶的方法，该方法包括下列步骤a)提供所述多肽的水溶液，b)向所述多肽水溶液中加入摩尔过量的配体，以及c)生长晶体。在本专利技术方法一个优选的实施方案中，所述水溶液包含5%-30% (w/v)PEG，其中 所述PEG平均分子量为200Da到20kDa、优选200Da到5kDa，更优选3，35kDa。在本专利技术方法另一个优选的实施方案中，所述水溶液包含OM到IMBis-Tris pH 5. 5, OM到0. 5M氯化镁和OM到0. 5M硫酸铵。在本专利技术方法另一个优选的实施方案中，所述水溶液包含摩尔过量的辅助激活因 子肽。本专利技术的共晶体可以使用多种技术生长，包括分批结晶、蒸汽扩散(坐滴或悬滴) 和微量透析。在某些情况下需要种晶以获得X射线级的晶体。因此可使用标准的微量和大 量种晶法。在本专利技术优选的实施方案中，共晶体通过蒸汽扩散法生长。在该方法中，使多肽溶 液在封闭的容器中与更大的贮液池平衡，所述贮液池具有产生晶体最佳的沉淀浓度。通常 将约10 μ 1以下的基本上纯的多肽溶液与等体积或体积类似的贮液池溶液混合，获得结晶需要浓度一半的沉淀浓度。将该溶液以小滴的形式放置在贮液池包围的密封塑料台上。密 封的容器可以放置1天到1年，通常为约2-6周，直到晶体生长。本专利技术的共晶体可采用下列方法获得，其包括提供3. 75到50mg/mlLXR β -LBD多 肽的缓冲水溶液，向所述多肽水溶液加入摩尔过量的配体和辅助激活因子肽，通过蒸气扩 散法或微量分批法使用0%到30% (w/v)PEG的缓冲贮存液生长晶体，其中所述PEG平均分 子量为200Da至20000Da。该PEG可以单甲基酯的形式加入。优选的PEG分子量为500Da 至5，OOODa0优选的缓冲贮存液还包括OM到IM Bis-Tris pH 5. 5，OM到0. 5M氯化镁以及 OM到0. 5M硫酸铵。所述微量分批法可以进行修改。在所述产生LXRii本文档来自技高网...

【技术保护点】
肝脏Ｘ受体β配体结合结构域（ＬＸＲβ－ＬＢＤ）与配体的共晶体，其中所述晶体属于空间群Ｐ４↓［３］。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：J本兹，B格塞尔，M斯蒂尔，R托马，M赖特，
申请(专利权)人：弗哈夫曼拉罗切有限公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]