油基和水基佐剂混合物制造技术

本发明专利技术涉及含有抗原物质和两种佐剂混合物的疫苗，其中的一种佐剂为油基，而另一种佐剂为水基。（*该技术在2014年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及含有抗原物质和佐剂的疫苗、制备所说疫苗的方法和佐剂组合物。水产养殖中的许多疾病是由条件病原菌，即在鱼或虾在虚弱或应激状态下能使之致病的细菌所致。这是实际养殖条件下常常存在的情形。对商业性水产养殖具有威胁性的细菌如红色耶尔森低菌-肠道石鲈病的致病原;鳗弧菌-古黄型弧菌病的致病原;杀鲑弧菌-引起冷水弧菌病;杀鲑气单胞菌-引起疖疡病，Salmoniarum肾细菌-细菌性肾病的致病原。疫苗和抗菌素的应用是两种保护养殖鱼不致病的可行性方法。但在水产养殖中必须大大减少抗菌素的应用以避免环境公害和产生抗菌素抗性的危险。已经有人报道应用(实验性)一疫菌抵抗某些鱼的细菌性病原菌(Holm,K.O.etal,J.FishDiseases11,389-396,1987;RΦrstad,G.etal,ConferenceonDiseasesinAsianAquaculture，Nov.1990Indonesia)。然而，有必要进一步提高抗某些上述病原菌疫苗的效力。而且，目前仍无抗鲑科鱼的疖疡病和细菌性肾病这类商业上重要的疾病和抗病毒性疾病的有效疫苗。例如，杀鲑气单胞菌代表了对商业水产生养殖的威胁。用死细菌针对上述病原菌接种反产生微弱的保护作用，这可能是由于灭活菌抗原的不良免疫性之故。因此，应用这灭活的疫苗迫切需要增强抗原的免疫原性，例如，借助于佐剂来达到上述目的。目前，在挪威已有数种油性佐剂疫苗商售，其中有两种是三个疫苗(Apoject3-Fural,ApothekernesLaboratoriumA.S.;Biojec1900,BiomedInc)。这些三价疫苗包括灭活的完整细菌，用于防止鲑的弧菌病、冷水弧菌病和疖疡病。这些疫苗的不足之处在于其相对弱的抗疖疡病效力和不良的物理特性，尤其是乳剂的粘滞度或稳定性。抗所说疾病更进一步的疫苗含有一种水基佐剂，即不含油，可从商业途径得自NorBioA/S(NorvaxTrippel)。所说疫苗中的水基佐剂是啤酒酵母的β-1，3和β-1，6连接的葡聚糖(MacroGard,可从KSBiotechMackzymal,TromsΦ,Norway购买)。酵母和丝状真菌的葡聚糖代表了一组水基佐剂(DiLuzio,N.R.,SpringerSeminarsinImmunopathology8,387-400，1985)。这些葡聚糖是真菌细胞壁普遍具有的最重要结构成分之一(Rosenberger,R.F.,TheCellWall.In:TheFilamentousFungi,Vol.2,eds.:smith＆Berry328-334，1976)。特别是，已经证实啤酒酵母细胞壁的β-1，3和β-1，6连接的葡聚糖和其它的真菌β-葡聚糖能增强鱼类对细菌感染的抵抗力(RΦrstad,G.etal.,Fish＆ShellfishImmunology3,179-190,1993;Yano,T.etal.,J.FishDiseases14，577-582，1991)。本专利技术提供了含有抗原物质和佐剂的疫苗，其特征在于所说的佐剂是油包水乳剂与免疫刺激性葡聚糖的结合物。现有技术已经知道，油包水乳剂(W/O)的佐剂效果部分在于其缓释作用，即存在于被分散水相中的抗原物质从连续的油相中缓慢地释出，因为油相逐步破散，籍此在接种后马上产生对免疫系统较理想的刺激作用。与此相反，为启动免疫应答可直接应用水基免疫刺激性葡聚糖。可以预料，将水基免疫刺激性葡聚糖掺入被分散的油包水乳剂的水相将导致该佐剂成分退出免疫系统。令人感到意外地是，已发现包含上述佐剂组合物的疫苗能在接种后很短的时间内诱导高度的保护性免疫应答。术语免疫刺激性葡聚糖意指由D葡萄糖型的重现单糖单位构成的一种多糖，其葡聚糖与抗原结合施用时能够增加在动物中诱发的抗抗原物质的免疫应答，超过了未加用葡聚糖时所观察到的免疫应答。本文优选β-葡聚糖，尤其是得自真菌细胞壁的β-葡聚糖用作佐剂成分。已知这些葡聚糖以非特异性和特异性方式成为免疫系统的强力刺激剂(Czop,J.K.etal.,JImmunol.135,3388-3393,1985;Ross,G.D.etal.,Complement4,61-74,1987;Diluzio,1985，出处同上)。这类β-葡聚糖的例子有分别来自群交裂褶菌、葡聚糖小核菌和香菇的Schizofiran、scleroglucan和香菇糖(Yanoetal，NipponSuisanGakkaishi55,1815-1819，1989)。特别优选的β-葡聚糖是得自啤酒酵母细胞壁的葡聚糖，尤其是β-1，3-1，6连接的葡聚糖(DiLuzioetal.，Int.J.Cancer24,773-779,1979;RΦrstad,G.etal.，1993,出处同上)，例如，M-葡聚糖(MacroGard佐剂，得自KSBiotecMackzymal,TromsΦ，Norway)。根据本专利技术，疫苗中葡聚糖的含量取决于所选用的葡聚糖的类型和疫苗中所用的油包水乳剂及特异性抗原，但选优的是在每剂疫苗含大约1～1000ug范围的葡聚糖，特别是每剂约50～600ug。最优选的是每剂用300ug。用于本专利技术中的油包水乳剂中的各个成分都是常规的，并为本领域的技术人员熟知。油性成分包括如Bayol(R)和Drakeol(R)一类的矿物油，但是可以代谢的、非毒性油类，优选地是含有6-30个碳原子，包括但不限于烷烃、烯烃、炔烃及其相应的酸和醇;醚及其酯;以及它们的混合物。所说的油可以是菜油、鱼油、动物油或经合成制备的油，它们能被将施予佐剂的机体所代谢，并且对施用对象无毒。所说的对象是动物，典型地是哺乳动物、鸟类或鱼类。任何可代谢的油类，特别是动物、鱼、蔬菜来源的可代谢油类可用于本专利技术。菜油的来源包括坚果类、种子和谷类。最常用的花生油、豆油、椰子油和橄榄油是坚果油的例证。种子油包括红花油、棉籽油、葵花籽油、芝麻油等。玉米油在谷类中是最容易得到的，但也可以使用其它谷类植物的油，如小麦、燕麦、黑麦、大米、埃塞俄比亚画眉草，黑小麦等等。大多数的鱼都含有易于被回收的可代谢油。例如，鳕鱼肝油、鲨鱼旰油和鲸油(如鲸蜡)是数种可用于本专利技术的鱼油的例子。大量支链油是以5碳异戊二烯单位经生物化学途径合成的，并通常被称为类萜烯化合物。鲨鱼肝油含有称为角鲨烯，2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯的支链，不饱和的类萜烯化合物。角鲨烯的饱和类似物角鲨烷也是优选的油。包括角鲨烯和角鲨烷在内的鱼油易于由商业来源或可从本领域已知的方法得到。本专利技术疫苗配方的油性成分含量为40-90%(W/W)，特别是含60-80%(W/W)，最优选的用量为70%(W/W)。正如已经熟知的，油包水乳剂的配方包括适当地选择乳化剂，这要求同时考虑到油和水相的相对比例及其确切的性质。乳化剂的比例是允许改变的，但最好是对其类型进行选择，并以各种浓度加以应用以使最终的亲疏平衡(HLB)数小于6。用于举证说明实施本专利技术思想的乳化剂例子包括Span80，Span85,Arlacel85和Arlacel83。特别适于制备掺入到本专利技术疫苗中的油包水型乳剂的，是曾在PCT专利中请本文档来自技高网...

【技术保护点】
含有抗原物质和佐剂的疫苗，其特征在于所说的佐剂是油包水乳剂与免疫刺激性葡聚糖的组合物。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：PM阿耀德，AH诺兰德，DH纳普考戈，
申请(专利权)人：阿克佐诺贝尔公司，
类型：发明
国别省市：NL[荷兰]