本发明专利技术描述了用于生产具有降低的Ｏ－联糖基化数量的蛋白质组合物的化合物和方法。所述方法包括在存在Ｐｍｔ介导的Ｏ－联糖基化的某些亚苄基噻唑烷二酮抑制剂的条件下培养的细胞中产生所述蛋白质。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】利用甘露糖基转移酶抑制剂有效生产异源蛋白质
技术介绍
糖蛋白在人和其它哺乳动物中调节许多必需功能，包括催化作用、信号转导、细胞 间通讯以及分子识别和缔合。在真核生物中，糖蛋白构成了非胞质蛋白质的的主要部分 (Lis和Sharon，1993，Eur.J. Biochem. 218 :1-27)。已开发了许多糖蛋白用于治疗目的。在 最近二十年间，天然发生的糖蛋白的重组形式已成为生物技术工业的主要部分。用作治疗 剂的重组糖基化蛋白质的实例包含红细胞生成素(EPO)、治疗性单克隆抗体(mAbs)、组织 纤维酶原激活物(tPA)、干扰素-β (IFN-β)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和 人绒毛膜促性腺素(hCH) (Cumming等人，1991，Glycobiology 1:115-130)。随着作为潜在 的预防剂和治疗剂而产生的重组蛋白质接近临床应用，重组产生的糖蛋白的糖基化模式的 变化近来已成为备受科学界关注的主题。一般地，糖蛋白寡糖的糖基化结构根据用来产生它们的细胞的宿主物种而变 化。非人宿主细胞产生的治疗性蛋白质很可能含有非人糖基化，可能引起人的免疫原性反 应，例如酵母中的超甘露糖基化(Ballou，1990，Methods Enzymo 1. 185 :440-470)、植物中 的 α (1,3)海藻糖禾口 β (1，2)-木糖(Cabanes-Macheteau 等人，1999. Glycobiology，9 365-372)、中国仓鼠卵巢细胞中的N-乙酰神经氨酸(Noguchi等人，1995. J. Biochem. 117 5-62)禾Π 小鼠中的 Gal α -l，3Gal 糖基化(Borrebaeck 等人，1993，Immun. Today, 14 477-479)。在动物细胞中与蛋白质结合的糖链(carbonydrate chains)包含与该蛋白质天 冬酰胺(Asn)残基结合的N-糖苷键型糖链(也称为N-聚糖；或N-联糖基化)和与该蛋白 质丝氨酸Ger)或苏氨酸(Thr)残基结合的0-糖苷键型糖链(也称为0-聚糖；或0-联糖 基化)。因为非人哺乳动物细胞产生的糖蛋白的寡糖结构倾向于更接近人糖蛋白的寡糖 结构，所以大多数商用糖蛋白是哺乳动物细胞产生的。但是，哺乳动物细胞作为产生蛋白质 的宿主细胞具有几个重要的缺点。除了费用高之外，哺乳动物细胞产生蛋白质的过程产生 糖形异质群、具有低的体积滴度、并需要进行性的病毒抑制和相当长的时间来产生稳定的 细胞系。充分认识到的是蛋白质上的具体糖形可能深刻地影响蛋白质的性质，包括它的药 物代谢动力学、药物动力学、受体相互作用和组织特异性靶向性质(Graddis等人，2002. Curr Pharm Biotechnol. 3 =285-297)。例如，已经显示了 Ig的不同糖基化模式与不同生物 学性质相关(Jefferis 和 Lund，1997，Antibody Eng. Chem. Immunol,65 :111-128 ；Wright 和 Morrison，1997，Trends Biotechnol. , 15 :26-32) 进一步已经显示了糖蛋白的半乳糖 基化可随细胞培养条件而变化，可使一些糖蛋白组合物产生免疫原性，这取决于糖蛋白上 的具体半乳糖模式(Patel等人，1992. Biochem J. 285 =839-845)。但是，因为还不知道哪种 具体糖形(或多种糖形)产生所希望的生物学功能，所以非常需要在糖蛋白上富集具体糖 形的能力。因为不同糖形与不同生物学性质相关，富集具有具体糖形的糖蛋白的能力可用 于阐明糖蛋白的具体糖形与该糖蛋白具体生物学功能之间的关系。另外，富集具有具体糖 形的糖蛋白的能力能够产生具有具体特异性的治疗性糖蛋白。因此，非常需要产生具体糖5形富集的糖蛋白组合物。虽然N-联糖基化的途径已成为许多分析的对象，但是0-联糖基化的过程和功能 还没有很好地理解。但是，已知的是，与N-联糖基化不同，0-糖基化是发生在顺面高尔基 体中的翻译后事件(Varki，1993，GlyC0bi0l.，3 :97-130)。尽管看上去对于0-联糖基化不 存在类似N-联糖基化的共有受体序列，但是几种糖蛋白大量0-联糖基化位点周围的氨基 酸序列比对显示在相对于糖基化残基的-1和+3位脯氨酸残基的频率增加，以及丝氨酸、 苏氨酸和丙氨酸残基的明显增加(Wilson等人，1991，Biochem. J.，275 :529-534)。在糖蛋 白中丝氨酸和苏氨酸残基的延伸也可能是0-糖基化的潜在位点。在0-联糖基化中发挥作用的一个基因家族是编码Do 1 -P-Man :蛋白质(Ser/ Thr)甘露糖基转移酶(Riit)的基因。在高等真核生物例如人、啮齿动物、昆虫等和低等真 核生物例如真菌等中已鉴定出这些高度保守的基因。酵母例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)编码最多七个编码Rnt同源物的PMT 基因(在 Wilier 等人 Curr. Opin. Struct. Biol. 2003 Oct ；13 (5) :621-30 中综述)。在酵 母中，通过七个0-甘露糖基转移酶基因之一在内质网中将起始甘露糖从多萜醇磷酸甘露 糖添加到新生糖蛋白的丝氨酸或苏氨酸残基上来启动0-联糖基化。尽管在酵母中出现七 个编码Riit同源物的PMT基因，但是在酵母中分泌型真菌和异源蛋白质的0-甘露糖基化主 要依赖PMTl和PMT2基因以及它们各自编码的蛋白产物Riitl和Riit2，这在各物种中是高度 保守的，Pmtl和Riit2看起来作为异源二聚体发挥作用。Tanner等人在美国专利号5，714，377中描述了酿酒酵母的PMTl和PMT2基因，以 及生产具有降低的0-联糖基化的重组蛋白质的方法，该方法利用PMT基因中的一个或多个 已被基因修饰的真菌细胞来产生具有降低的0-联糖基化的重组蛋白质。Ng等人在美国公开的专利申请号20020068325中公开了通过利用反义或共抑制 或者通过酵母宿主菌株的工程化来抑制0糖基化，所述酵母宿主菌株具有与0-联糖基化相 关基因的功能丧失突变，具体地是一个或多个PMT基因的功能丧失突变。UDP-N-乙酰基-α -D-半乳糖胺多肽N-乙酰基半乳糖胺基-转移酶(GalNAc-转 移酶)参与在高等真核生物中发现的黏蛋白型0-联糖基化。这些酶启动蛋白质中具体的丝 氨酸和苏氨酸氨基酸的0-糖基化，这是通过将N-乙酰半乳糖胺添加到这些氨基酸的羟基 上来进行的，然后甘露糖残基可以分步的方式添加。Clausen等人在美国专利号5，871，990 和美国公开的专利申请号20050(^6^6中公开了编码UDP-N-乙酰基-α -D-半乳糖胺多 肽N-乙酰基半乳糖胺基-转移酶(GalNAc-转移酶)的核酸家族。Clausen在美国公开的 专利申请号20030186850中公开了 GaINAc-β -苄基选择性地抑制多肽feilNAc-转移酶的 凝集素的用途，并且feINAc- β -苄基不用作参与0-聚糖生物合成的其它糖基转移酶的底 物，从而抑制0本文档来自技高网...
【技术保护点】
选自以下组的化合物或其盐： ＊＊＊。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：R德赛，L杨，
申请(专利权)人：默沙东公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。