抑制异戊二烯基蛋白质转移酶表达的寡核苷酸制造技术

本发明专利技术涉及抑制异戊二烯基蛋白质转移酶表达的寡核苷酸及其衍生物、含有该化合物的治疗组合物以及利用该寡核苷酸组合物治疗人体或动物体内因异常和／或无控制的细胞增殖而引起的疾病。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及抑制异戊二烯基蛋白质转移酶表达的寡核苷酸及其衍生物、含该类化合物的治疗组合物以及利用该类寡核苷酸组合物治疗因异常和/或无控制细胞增殖而引起的人或动物体内疾病。任何生物(不管是单细胞还是多细胞的)都表现出其繁殖的能力，这一现象需要遗传物质(如DNA等)的复制以及所复制DNA在两个“子”细胞间的平均分配。存在着大量具促有丝分裂活性的形形色色的分子，它们以“细胞特异性”方式发挥作用。“信号”分子或生长因子是多肽类型的，它们的量很低，在与靶细胞相互作用之后可以引发一连串终止DNA复制及有丝分裂的活动。生长因子并不直接作用于细胞循环，而是通过位于靶细胞质膜上的一系列横跨膜受体的相互作用和活化作用。这种机制触发了细胞内导致有丝分裂的链式反应。所激活的胞内活动可能因同一受体的不同细胞类型而有所变化。使生长因子与其受体相连接的第一阶段之一是激酶蛋白质的激活和蛋白质的磷酸化。构成这种信号转导连接的蛋白质之一是蛋白质ras，即由异戊烯化作用机制修饰的一种21K—道尔顿的蛋白质。异戊烯化作用是一种转译后修饰，其包括异戊烯基组群与多种蛋白质的半胱氨酸的共价连接。这样异戊烯化作用就可以是法呢基组群或牻牛儿基一牻牛儿基组群向靶蛋白质的转移。这种修饰使某些蛋白质自身附着到膜作用位点上。抑制这种异戊烯化作用的后果之一是阻止了胞外信号向细胞核内的转导作用以及细胞增殖。迄今为止，已表征了催化这种修饰的三类酶法呢基蛋白质转移酶、I型和II型牻牛儿基—牻牛儿基蛋白质转移酶。所有这些酶都能识别位于蛋白质羧基末端的同感序列。阻断这些酶合成的后果之一是阻断引起细胞增殖的主要信号传递途径。大多数典型性有效成份与蛋白质，即遗传信息的转译产物相互作用并抑制其功能。本专利技术涉及一种新近的治疗方法反义对策。该方法旨在通过核苷酸链(寡核苷酸)与其在信使或前信使RNA或DNA上的互补序列的选择性配对而进行基因表达的选择性调节，并因此抑制相应蛋白质的合成。所使用的分子直接相互作用于遗传信息级联。与转录产物互补的寡核苷酸被称为“反义”寡核苷酸。与转录产物具有相同序列的寡核苷酸称为“有意义”寡核苷酸。最初，这些化合物被合理设计以通过相应信使RNA经RNA酶H介导的水解机制的脱落抑制基因产物的形成。不久，发现这些反义寡核苷酸的作用机制并不如此简单。这些寡核苷酸可与不同数目的非核酸细胞靶相互作用。这些寡核苷酸可与基因相互作用而形成三股螺旋结构并抑制转录产物的形成。寡核苷酸可与前信使RNA内含子—外显子接点相互作用，因而干扰转录产物的正确拼接。寡核苷酸可通过形成RNA—DNA双螺旋而与胞质中的mRNA杂交，其因RNA酶H或因阻止核糖体复合物滑过mRNA而迅速降解，因而阻断转译。寡核苷酸(特别是修饰的寡核苷酸)可与许多细胞组分(如蛋白质)相互作用。这些相互作用可以是序列特异性的(如转录因子)，也可以是非序列特异性的(如生长因子)。这样，寡核苷酸(SEQ ID NOs.1—36)可通过上述机制之一或组合而引起增殖停滞。本专利技术尤其旨在利用反义寡核苷酸来阻断上述酶的合成。这意味着其可作为抗增殖剂而用于心血管疾病、肿瘤学、皮肤学、某些病毒感染和任何其它与细胞增殖有关的病理状况。在反义方法学中，可使用反义寡核苷酸或反义RNA。反义寡核苷酸方法学不同于反义RNA。在后者中，基因的DNA片段在正常意义相对方向上被插入载体DNA内，这样，在所述载体转录期间，其DNA的螺链之一在RNA中得到复制。基因反向片段的插入引起了RNA的原位合成，该RNA与由细胞本身合成的正常mRNA互补。这种RNA(称为反义RNA)可杂交以正常表达mRNA，因而抑制靶蛋白质的转译。Prendergast等人已使用了这种方法(细胞生长与分化4，707—713,1993年9月)以评估法呢基蛋白质转移酶的作用对该法呢基蛋白质转移酶β—亚基之cDNA进行克隆并提纯；对靶细胞进行遗传工程处理以原位表达反义RNA分子。反义RNA方法尤其适用作机制工具以搞清蛋白质在细胞中的作用和最终用作治疗剂(应用复杂性基因治疗方案)，而反义寡核苷酸作为药物更具吸引力，并被制定规章的部门视为典型性化学品。而且，可通过经典化学很容易地大量合成寡核苷酸，而反义RNA分子可在生物体系中产生，但以工业化规模生产则障碍颇多。在EP456180中已研究过法呢基蛋白质转移酶的剂量方法尤其是可用上述方法对法呢基蛋白质转移酶潜在抑制剂活性进行测度。但是，这种方法并没有给出法呢基蛋白质转移酶新型潜在抑制剂的结构，该专利也没有描述与本专利技术相关的任何分子。本专利技术提供了可选择性与异戊二烯基蛋白质转移酶亚基之基因或转录产物，优选的是异戊二烯基蛋白质转移酶亚基α和/或β之基因或转录产物杂交的寡核苷酸(反义或有意义)。寡核苷酸可由2—50个单位，优选8—35个单位组成。更优选的是由10—25个单位组成。可通过任何已知寡核苷酸化学合成法来合成本专利技术的寡核苷酸。最有利的是使用任意商业上可得到的，自动化核酸合成仪制备寡核苷酸。寡核苷酸合成法之一是β—氰乙基氨基磷酸酯法，如S.L.Beaucage等人所述。本专利技术还提供了这类寡核苷酸的衍生物，即，已在寡核苷酸整体长度上或5’和3’位两处或其中一处修饰了主链的寡核苷酸。事实上寡核苷酸对酶，即将其水解成核苷酸的核酸酶具有敏感性；通过对糖本身化学性质或磷酸酯—糖核苷酸间的键进行修饰，寡核苷酸变得对核酸酶具有耐受性；这样磷酸二酯链就可被取代，如被硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、膦酸甲酯、氨基磷酸酯、磷酸乙基三酯、丁基酰胺化物、哌嗪化物或吗啉化物链所取代。可在寡核苷酸整个长度上或在5’和/或3’端处进行其它类型的修饰，以使寡核苷酸在生物环境中更具耐受性。另外，核苷酸之间的磷酸酯键可被酰胺键替代(肽核酸)。再者，寡核苷酸的横跨膜通道因使寡核苷酸更具疏水性而得到促进；例如，通过连接疏水取代物(如胆固醇、芳香族组群或聚合物)可达到这一目的。可部分地或在寡核苷酸的整个长度上掺入修饰的碱基。也可部分地或在寡核苷酸的整个长度上掺入可耐受核酸酶或提高杂交或胞内摄取特性的构象改变的核苷酸(如具有α—异头物构象的寡核苷酸)。这样，术语“衍生物”包括以上述方法之一或专业人员所熟知的其它方法进行修饰的核苷酸。本专利技术优选的寡核苷酸分别为序列SEQ ID NO.1—SEQ IDNO.36的寡核苷酸。依据本专利技术，也可以使用其互补序列或有意义寡核苷酸。本专利技术进而提供了包括选自SEQ ID NO.1—SEQ ID NO.36中序列之一至少一部分的寡核苷酸。本专利技术还提供了含有作为有效成分的至少一种本专利技术的反义寡核苷酸的治疗组合物，该有效成分与适合于所选定的给药方法的药用性稀释剂和/或载体相混合。该组合物可局部或全身性施用；其形式有注射液、脂质体、缓释制剂，凝胶、局部使用的软膏或适于所选定的给药方法的其它可用形式。最后，本专利技术提供了本专利技术的组合物在对细胞增殖异常和/或无控制的人或动物体进行治疗的方法中的应用。下列实施例可说明本专利技术。实施例1反义寡核苷酸对大鼠平滑肌增殖的作用通过酶消化(胶原酶和弹性蛋白酶)分离出雄性Wistar大鼠主动脉中的平滑肌细胞，在DMEM培养基中培养，培养基中含有10％的胎牛血清(FCS)、2mM谷氨酰胺、50U/ml的青霉素和5本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可选择性与异戊二烯基蛋白质转移酶亚基之基因或转录产物杂交的寡核苷酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：S考劳特，E瑟罗兹基，
申请(专利权)人：科学研究与运用咨询公司，
类型：发明
国别省市：FR[法国]