一种大肠杆菌感受态细胞的制备方法技术

一种大肠杆菌感受态细胞的制备方法，属于微生物技术领域，其制备方法是：将离心管和新型制备液放入－２０℃８－１４小时，取菌株接种于ＬＢ平板，倒置３７℃培养１２－１６小时；挑取单菌落接种于５ｍｌＬＢ液体培养基中，３７℃摇床生长，取２ｍｌ培养物转种于２００ｍｌ新鲜ＬＢ培养液中继续生长至菌液ＯＤ６００为０．３－０．５；将菌液分装于冰冻的离心管中冰浴５ｍｉｎ，４℃，离心５ｍｉｎ，回收细胞；弃尽上清液，加入预冷的新型制备液重悬沉淀分装。有益效果是：获得了较高的转化率，对分子克隆实验意义重大。该方法操作简单，重复性好，转化效率高，具有极高的应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物

技术介绍
转化是将外源DNA分子引入受体细菌，使之获得新的遗传性状。这是现代分子生 物学最基本的操作技术。转化效率直接影响前后试验的进展和工作效率，而感受态细胞的 状态是影响转化效率最直接、关键的因素之一。通常有两种方法获得感受态细胞，一种是购 于商业公司，这种感受态通常有较高的转化效率，每微克质粒DNA产生108个转化克隆的转 化效率，但价格比较昂贵。另一种方法是实验室自己制备。目前常用的感受态细胞制备方 法有CaC12和RbCl/KCl法。RbCl/KCl法的感受态细胞转化效率较高，但需要特殊的试剂 RbCl, CaC12法简便易行，但转化效率较低。除上述两种方法外，还有制备超级感受态细胞 的Inoue法和电穿孔法，Inoue法细菌的培养条件是18°C，一般的实验室很难达到。电穿孔 法要求电穿孔仪，一般实验室不具有该设备。因而，研究一种转化效率高，重复性好，操作简 单适用于普通实验室的感受态制备方法对与分子生物学的研究尤为必要，对分子克隆实验 具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种大肠杆菌感受态细胞(E. col !Competent Cells)的制 备方法，它是一种转化效率高、方便、快捷、重复性好的感受态细胞制备和质粒转化方法。本专利技术的制备方法是1)材料LB液体培养基蛋白胨8-12，酵母膏4-6，NaCl 8_12，蒸馏水定容900-1100， PH7. 0,121°C灭菌20min。上述材料均为重量单位。新型制备液0. 06M-0. IM的氯化钙溶液中PEG3350占体积比6_12%，甘油占体积 比10-15%，加超纯水定容，121°C灭菌20min。2)方法预先将灭菌的离心管和新型制备液放入-20°C冰箱8-14小时，待制备感受态细胞 时备用。所有的操作均要在冰上执行。取菌株分区划线接种于LB平板，倒置37°C培养12-16小时；挑取单菌落接种于 5ml LB液体培养基中，37°C摇床生长，取2ml培养物转种于200ml新鲜LB培养液中继续生 长至菌液0D600为0. 3-0. 5 ；将菌液分装于冰冻的离心管中冰浴5min，4°C，离心5min，回收 细胞；弃尽上清，将细菌沉淀重新悬浮于预冷的新型制备液中，冰浴5min ；4°C离心5min ；弃 尽上清液将细菌沉淀重新悬浮于预冷的新型制备液，于4°C离心5min ；弃尽上清液，加入预 冷的新型制备液重悬沉淀，分装。本专利技术的有益效果是将氯化钙，甘油，PEG3350有机的按照一定的比例混在一 起，制备感受态细胞，获得了较高的转化率，对分子克隆实验意义重大。该方法操作简单，重复性好，转化效率高，不但能满足常规的分子实验要求，还能够满足构建文库等复杂实验对 转化效率的要求，是一项较为实用的新技术，具有极高的应用价值。表1三种方法制备感受态转化效率比较权利要求，其制备方法是a、材料LB液体培养基蛋白胨8 12，酵母膏4 6，NaCl 8 12，蒸馏水定容900 1100，PH7.0，121℃灭菌20min；上述材料均为重量单位；新型制备液0.06M 0.1M的氯化钙溶液中PEG3350占体积比6 12％，甘油占体积比10 15％，加超纯水定容，121℃灭菌20min；b、方法预先将灭菌的离心管和新型制备液放入 20℃冰箱8 14小时，待制备感受态细胞时备用，所有的操作均要在冰上执行；取菌株分区划线接种于LB平板，倒置37℃培养12 16小时；挑取单菌落接种于5ml LB液体培养基中，37℃摇床生长，取2ml培养物转种于200ml新鲜LB培养液中继续生长至菌液OD600为0.3 0.5；将菌液分装于冰冻的离心管中冰浴5min，4℃，离心5min，回收细胞；弃尽上清，将细菌沉淀重新悬浮于预冷的新型制备液中，冰浴5min；4℃离心5min；弃尽上清液，将细菌沉淀重新悬浮于预冷的新型制备液，于4℃离心5min；弃尽上清液，加入预冷的新型制备液重悬沉淀，分装。全文摘要，属于微生物
，其制备方法是将离心管和新型制备液放入-20℃8-14小时，取菌株接种于LB平板，倒置37℃培养12-16小时；挑取单菌落接种于5mlLB液体培养基中，37℃摇床生长，取2ml培养物转种于200ml新鲜LB培养液中继续生长至菌液OD600为0.3-0.5；将菌液分装于冰冻的离心管中冰浴5min，4℃，离心5min，回收细胞；弃尽上清液，加入预冷的新型制备液重悬沉淀分装。有益效果是获得了较高的转化率，对分子克隆实验意义重大。该方法操作简单，重复性好，转化效率高，具有极高的应用价值。文档编号C12R1/19GK101993830SQ20091006745公开日2011年3月30日 申请日期2009年8月28日 优先权日2009年8月28日专利技术者刘基伟, 吴健, 张国梁, 张鹏举, 李旭, 胡成华 申请人:吉林省农业科学院本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种大肠杆菌感受态细胞的制备方法，其制备方法是：ａ、材料ＬＢ液体培养基：蛋白胨８－１２，酵母膏４－６，ＮａＣｌ　８－１２，蒸馏水定容９００－１１００，ＰＨ７．０，１２１℃灭菌２０ｍｉｎ；上述材料均为重量单位；新型制备液：０．０６Ｍ－０．１Ｍ的氯化钙溶液中ＰＥＧ３３５０占体积比６－１２％，甘油占体积比１０－１５％，加超纯水定容，１２１℃灭菌２０ｍｉｎ；ｂ、方法预先将灭菌的离心管和新型制备液放入－２０℃冰箱８－１４小时，待制备感受态细胞时备用，所有的操作均要在冰上执行；取菌株分区划线接种于ＬＢ平板，倒置３７℃培养１２－１６小时；挑取单菌落接种于５ｍｌ　ＬＢ液体培养基中，３７℃摇床生长，取２ｍｌ培养物转种于２００ｍｌ新鲜ＬＢ培养液中继续生长至菌液ＯＤ６００为０．３－０．５；将菌液分装于冰冻的离心管中冰浴５ｍｉｎ，４℃，离心５ｍｉｎ，回收细胞；弃尽上清，将细菌沉淀重新悬浮于预冷的新型制备液中，冰浴５ｍｉｎ；４℃离心５ｍｉｎ；弃尽上清液，将细菌沉淀重新悬浮于预冷的新型制备液，于４℃离心５ｍｉｎ；弃尽上清液，加入预冷的新型制备液重悬沉淀，分装。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张鹏举，张国梁，吴健，李旭，刘基伟，胡成华，
申请(专利权)人：吉林省农业科学院，
类型：发明
国别省市：22[中国|吉林]