具有β－葡糖苷酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸制造技术

本发明专利技术涉及具有β－葡糖苷酶活性的分离的多肽和编码该多肽的分离的多核苷酸。本发明专利技术还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞以及产生和使用所述多肽的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有β -葡糖苷酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸涉及序列表本申请含有计算机可读形式的序列表。将所述计算机可读形式通过提述并入本 文。专利技术背景 专利
本专利技术涉及具有葡糖苷酶活性的分离的多肽和编码该多肽的分离的多核苷 酸。本专利技术还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞，以及产生和使用 所述多肽的方法。相关技术描述纤维素是单糖葡萄糖通过β_1，4-键连接的聚合物。许多微生物产生水解 β-连接的葡聚糖的酶。这些酶包括内切葡聚糖酶、纤维二糖水解酶和β-葡糖苷酶。 内切葡聚糖酶在随机位置消化所述纤维素聚合物，使其开放以受到纤维二糖水解酶的攻 击。纤维二糖水解酶按顺序自所述纤维素聚合物末端释放纤维二糖分子。纤维二糖是葡 萄糖的水溶性β -1，4连接的二聚体。β “葡糖苷酶将纤维二糖水解为葡萄糖。将纤维素原料转化为乙醇具有如下优点大量原料现成可得，期望避免焚烧或 填埋所述材料，以及乙醇燃料的清洁性。木材、农业残余物、草本作物和城市固体废物 已经被考虑作为供乙醇产生的原料。这些材料主要由纤维素、半纤维素和木质素组成。 一旦纤维素转化为葡萄糖，葡萄糖即容易地由酵母发酵为乙醇。由于葡萄糖容易通过各 种酵母发酵成乙醇，而纤维二糖则不能，因此在水解结束时残余的任何纤维二糖都代表 着乙醇产量的损失。更重要的是，纤维二糖是内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶的强力抑 制剂。纤维二糖在水解过程中的累积不利于乙醇生产。纤维二糖的累积在酶促水解中已经成为一个主要问题，因为产生纤维素酶的微 生物可能几乎不产生β _葡糖苷酶。β _葡糖苷酶的量少导致将纤维二糖水解成葡萄糖的 能力不足。已有几种方法用于在将纤维素转化成葡萄糖时增加β“葡糖苷酶的量。一种方案是使用几乎不产生纤维素酶的微生物产生葡糖苷酶，且向内切葡 聚糖酶和纤维二糖水解酶外源添加β-葡糖苷酶，从而增强水解。第二种方案是在进行纤维素水解的同时通过酵母进行葡萄糖发酵。这个过程称 为同步糖化和发酵(SSF)。在SSF系统中，葡萄糖发酵从溶液中除去了葡萄糖。然而 SSF系统在商业上尚不可行，因为对于所需要的50°C条件而言，28°C的酵母操作温度太 低了。克服β -葡糖苷酶不足的第三种方案是在宿主中过表达β -葡糖苷酶，从而增加 β-葡糖苷酶的产量。J0rgensen等，2003，Enzyme and Microbial Technology 32 851-861，Thygesen 等，2003，Enzyme and Microbial Technology 32 606-615，以及 J0rgensen和 Olsson， 2006，Enzyme and Microbial Technology 38 381-390 公开了来自巴西青霉(Penicilliumbrasilianum)IBT 20888的纤维素降解酶。对本领域有利的是，提供具有改善性能的新型葡糖苷酶用于将纤维素材料 转化成单糖、二糖、和多糖。本专利技术提供具有β -葡糖苷酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸。
技术实现思路
本专利技术涉及选自下组的具有β “葡糖苷酶活性的分离的多肽(a) 一种包含如下氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列包含与SEQ IDNO 2的 氨基酸20到267的部分氨基酸序列具有至少75%同一性的部分氨基酸序列；(b) 一种由包含如下核苷酸序列的多核苷酸编码的多肽，所述核苷酸序列包含在 至少高严紧条件下与以下杂交的部分核苷酸序列(i)SEQIDNO: 1的核苷酸58到1081 的部分核苷酸序列，(ii)包含于SEQ ID NO: 1的核苷酸58到1081的部分核苷酸序列中 的cDNA序列，或(iii) (i)或(ii)的全长互补链；(c) 一种由包含如下核苷酸序列的多核苷酸编码的多肽，所述核苷酸序列包含与 SEQ IDNO 1的核苷酸58到1081的部分核苷酸序列具有至少75%同一性的部分核苷酸 序列；和(d) —种包含如下氨基酸序列的变体，所述氨基酸序列包含取代、缺失和/或插 入一个或多个(几个)氨基酸的SEQ ID NO 2的氨基酸20到267的部分氨基酸序列。本专利技术还涉及选自下组的分离的多核苷酸，其编码具有葡糖苷酶活性的多 肽(a) 一种编码包含如下氨基酸序列的多肽的多核苷酸，所述氨基酸序列包含与 SEQ ID NO 2的氨基酸20到267的部分氨基酸序列具有至少75%同一性的部分氨基酸 序列；(b) 一种包含如下核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列包含在至少高严紧条 件下与以下杂交的部分核苷酸序列(i) SEQ ID NO 1的核苷酸58到1081的部分核苷 酸序列，(ii)包含于SEQ IDNO 1的核苷酸58到1081的部分核苷酸序列中的cDNA序 列，或(iii) (i)或(ii)的全长互补链；(c) 一种包含如下核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列包含与SEQID NO 1的核苷酸58到1081的部分核苷酸序列具有至少75%同一性的部分核苷酸序列；和(d) 一种编码包含如下氨基酸序列的变体的多核苷酸，所述氨基酸序列包含取 代、缺失和/或插入一个或多个(几个)氨基酸的SEQ ID NO 2的氨基酸20到267的 部分氨基酸序列。本专利技术还涉及包含所述多核苷酸的核酸构建体、重组表达载体、重组宿主细 胞，和产生具有葡糖苷酶活性的多肽的方法。本专利技术还涉及抑制细胞中具有葡糖苷酶活性的多肽表达的方法，包括向所 述细胞施用或在所述细胞中表达双链RNA(dsRNA)分子，其中所述dsRNA包含本专利技术的 多核苷酸的亚序列。本专利技术还涉及这样的双链抑制性RNA(dsRNA)分子，其中任选地所 述 dsRNA 是 siRNA 或 miRNA 分子。本专利技术还涉及在纤维素转化为葡萄糖和各种物质中使用具有β -葡糖苷酶活性的多肽的方法。本专利技术还涉及包含编码具有葡糖苷酶活性的多肽的分离的多核苷酸的植 物。本专利技术还涉及产生具有葡糖苷酶活性的多肽的方法，包括(a)在有益于所 述多肽产生的条件下，培养转基因植物或植物细胞，所述转基因植物或植物细胞包含编 码所述具有葡糖苷酶活性的多肽的多核苷酸；和(b)回收所述多肽。本专利技术另外还涉及编码信号肽的分离的多核苷酸，所述信号肽包含SEQID NO 2的氨基酸1到19或由SEQ ID NO 2的氨基酸1到19组成；还涉及包含所述多核苷酸 的核酸构建体、表达载体和重组宿主细胞；以及产生蛋白质的方法。附图简述附图说明图1显示巴西青霉IBT 20888家族3 β -葡糖苷酶的部分基因组DNA序列和推导 的氨基酸序列(分别为SEQ ID NO 1和2)。定义β-葡糖苷酶术语“β-葡糖苷酶”在本文中定义为一种β-D-葡糖苷葡糖 水解酶(E.C.3.2.1.21)，其催化水解末端非还原性β-D-葡萄糖残基，并释放β-D-葡萄 糖。就本专利技术而言，β-葡糖苷酶活性是根据Venturi等，2002，J.BasicMicrobiol.42 55-66记载的基本方法来测定的，除非如本文所述使用了不同的条件。一个单位的葡 糖苷酶活性定义为在50mM柠檬酸钠中，在25°C、pH 4.8条件下每分钟从作为底物的 ImM 4-硝基苯基-β -D-吡喃葡萄糖苷产生1.0微摩尔4-硝基苯酚。本文档来自技高网...

【技术保护点】
具有β－葡糖苷酶活性的分离的多肽，其选自下组：（ａ）包含如下氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列包含与ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２的氨基酸２０到２６７的部分氨基酸序列具有至少８５％同一性的部分氨基酸序列；（ｂ）由包含如下核苷酸序列的多核苷酸编码的多肽，所述核苷酸序列包含在至少高严紧条件下与以下杂交的部分核苷酸序列：（ｉ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１的核苷酸５８到１０８１的部分核苷酸序列，（ｉｉ）包含于ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１的核苷酸５８到１０８１的部分核苷酸序列中的ｃＤＮＡ序列，或（ｉｉｉ）（ｉ）或（ｉｉ）的全长互补链；（ｃ）由包含如下核苷酸序列的多核苷酸编码的多肽，所述核苷酸序列包含与ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１的核苷酸５８到１０８１的部分核苷酸序列具有至少８５％同一性的部分核苷酸序列；和（ｄ）包含如下氨基酸序列的变体，所述氨基酸序列包含取代、缺失和／或插入一个或多个（几个）氨基酸的ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２的氨基酸２０到２６７的部分氨基酸序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2008-3-6 61/034,4391.具有β-葡糖苷酶活性的分离的多肽，其选自下组(a)包含如下氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列包含与SEQID NO: 2的氨基酸20 到267的部分氨基酸序列具有至少85%同一性的部分氨基酸序列；(b)由包含如下核苷酸序列的多核苷酸编码的多肽，所述核苷酸序列包含在至少高严 紧条件下与以下杂交的部分核苷酸序列(i)SEQIDNO: 1的核苷酸58到1081的部分核 苷酸序列，(ii)包含于SEQ ID NO 1的核苷酸58到1081的部分核苷酸序列中的cDNA 序列，或(iii) (i)或(ii)的全长互补链；(C)由包含如下核苷酸序列的多核苷酸编码的多肽，所述核苷酸序列包含与SEQ ID NO 1的核苷酸58到1081的部分核苷酸序列具有至少85%同一性的部分核苷酸序列； 和(d)包含如下氨基酸序列的变体，所述氨基酸序列包含取代、缺失和/或插入一个或 多个(几个)氨基酸的SEQ ID NO 2的氨基酸20到267的部分氨基酸序列。2.权利要求1的多肽，其包含含有SEQID NO 2的氨基酸20到267的部分氨基酸 序列的氨基酸序列；或其具有葡糖苷酶活性的片段。3.分离的多核苷酸，其包含编码权利要求1或2所述的多肽的核苷酸序列。4.核酸构建体，其包含权利要求3的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接于一个或 多个(几个)调控序列，所述调控序列指导该多肽在表达宿主中产生。5.重组宿主细胞，其包含权利要求4的核酸构建体。6.产生权利要求1或2所述的多肽的方法，包括(a)在有益于所述多肽产生的条件 下培养细胞，所述细胞以其野生型形式产生该多肽；和(b)回收所述多肽。7.产生权利要求1或2所述的多肽的方法，包括(a)在有益于所述多肽产生的条件 下培养包含核酸构建体的宿主细胞，所述核酸构建体包含编码该多肽的核苷酸序列；和 (b)回收所述多肽。8.产生亲本细胞的突变体的方法，包括破坏或缺失编码权利要求1或2所述的多肽的 核苷酸序列，其导致所述突变体与所述亲本细胞相比产生较少的该多肽。9.产生权利要求1或2所述的多肽的方法，包括(a)在有益于所述多肽产生的条件 下培养转基因植物或植物...

【专利技术属性】
技术研发人员：克里斯琴克罗，保罗哈里斯，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：发明
国别省市：DK