本发明专利技术提供可用作疫苗的感染性嵌合ＨＣＶ颗粒。本发明专利技术还提供：核酸，该核酸含有来自丙型肝炎病毒的嵌合基因，所述嵌合基因是将编码来自ＪＦＨ－１株以外的丙型肝炎病毒株的核心蛋白、Ｅ１蛋白、Ｅ２蛋白和ｐ７蛋白、来自上述ＪＦＨ－１株或上述ＪＦＨ－１株以外的丙型肝炎病毒株的ＮＳ２蛋白或来自上述ＪＦＨ－１株的ＮＳ２蛋白与来自上述ＪＦＨ－１株以外的丙型肝炎病毒株的ＮＳ２蛋白的嵌合ＮＳ２蛋白、以及来自上述ＪＦＨ－１株的ＮＳ３蛋白、ＮＳ４Ａ蛋白、ＮＳ４Ｂ蛋白、ＮＳ５Ａ蛋白和ＮＳ５Ｂ蛋白的各区按照该顺序从５’侧向３’侧配置而形成的，其中，从上述核心蛋白的Ｎ末端的氨基酸残基数起，第３２８位的脯氨酸残基被取代成脯氨酸残基以外的氨基酸残基；含有该核酸的嵌合ＨＣＶ颗粒；以及该ＨＣＶ颗粒作为疫苗的应用。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及含有来自丙型肝炎病毒的嵌合基因的核酸、JFH-I株与JFH-I株以外 的株(优选属于基因型la、Ib或2a的株)的嵌合丙型肝炎病毒颗粒、用于生产该病毒颗 粒的载体、以及生产该病毒颗粒的细胞。本专利技术还涉及使用该病毒颗粒来筛选抗HCV药的方法、将该病毒颗粒灭活或减 毒而得到的疫苗、以及将该病毒颗粒作为抗原识别的抗丙型肝炎病毒抗体。
技术介绍
丙型肝炎病毒(以下简称为“HCV” )于1989年由Ch00等人发现并鉴定为非 甲型非乙型肝炎的病因病毒(非专利文献1)。HCV感染是继慢性肝炎后仍持续感染并向 肝硬化、肝癌转变的主要病因，据报道，全球有约1亿7千万HCV感染者，日本就存在 约200万HCV感染者。HCV的主要感染途径是血液感染，自从可以进行输血用血液的 筛选后，虽说我国新的感染者锐减，但认为仍存在许多病毒携带者。目前的疗法主要是给予PEG化干扰素、或者将PEG化干扰素与抗病毒药利巴韦 林结合使用。迄今为止，人们将HCV分为6个基因型，在日本主要是基因型Ib和2a。 特别是关于基因型lb，其现实状况是即使给予干扰素和利巴韦林，也无法从体内完全 除去病毒，治疗效果也不充分。鉴于上述情况，人们希望开发以预防发病或排除病毒为 目的的新型抗病毒药或疫苗。进行HCV治疗药的开发时，除黑猩猩外，再无反映病毒感染的有效动物， 也不存在有效的体外病毒培养系统，这都成为阻碍。近年来，人们开发了可以评价 HCV-RNA的复制的HCV复制子(非专利文献2)，其作为与抑制病毒复制有关的HCV抑 制剂的筛选系统取得了重大的进步。HCV是基因组全长约9.6kb的正链的单链RNA病毒，翻译后经蛋白酶的剪切， 具有编码作为10种病毒蛋白(核心、El、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A 和NS5B)的前体蛋白的基因。复制子系统是将HCV的结构蛋白的翻译区重组到耐药性 基因中，再在其下游插入EMCV(脑心肌炎病毒)的IRES而得到的系统，在导入有该重 组RNA的细胞内确认到RNA复制。但是，即使将含有HCV的结构蛋白的全长基因组 RNA导入细胞中，也没有确认到病毒颗粒释放到培养液中(非专利文献3)。近年来，由Wakita等人发现了从重症肝炎患者中分离的、属于基因型2a的HCV 株JFH1，明确了其以感染性病毒颗粒的形式被释放到Huh-7细胞(肝癌细胞株)培养液 中(专利文献1、非专利文献4)。该感染性HCV颗粒的体外培养系统被期待着在抗HCV 药开发中能够成为有用的筛选工具、同时在HCV疫苗的制作中也能成为有效的方法，进 行了在体外培养系统中产生HCV颗粒的研究，判明可以产生病毒颗粒的HCV基因组是 JFH-I株与JFH-I株以外的HCV的嵌合HCV。该嵌合HCV可以通过将JFH-I基因组的 结构基因、即核心、El、E2和p7蛋白编码部分与其他HCV株的结构基因重组来制作。作为JFH-I株以外的HCV株与JFH-I株的嵌合HCV，已知有J6CF株(基因型2a)与JFH-I株的嵌合HCV (非专利文献5)、H77株(基因型la)与JFH-I株的嵌合 HCV (专利文献2、非专利文献6)、以及S52株(基因型3a)与JFH-I株的嵌合HCV (非 专利文献7)。非专利文献8中显示包含J6CF的结构基因和JFH-I的非结构基因的嵌合HCV 的病毒产量最高，而作为基因型Ib的Conl株与JFH-I株的嵌合HCV的感染性HCV颗 粒的产量为1/10以下。作为其他基因型Ib株与JFH-I株的嵌合HCV，专利文献3中记 载着制作将编码TH株的结构蛋白的区与JFH-I基因组重组、并在其编码基因上游插 入耐药性基因的基因组(全长基因组复制子RNA)，将其导入Huh-7细胞中后获得耐药性 株，从而在其培养上清中产生感染性HCV颗粒，但没有阐明其生产性。鉴于上述状况，人们需要开发可以使对现有疗法的见效性差、而且具有患者人 数多的基因型Ib结构的感染性HCV颗粒高产、并且可以在持续感染系统中培养的HCV 颗粒生产法。专利文献1 国际公开W005080575A1专利文献2 国际公开W006096459A2专利文献3 国际公开W006022422A1非专利文献1: Choo，QL 等人，Science，244 359-362，1989非专利文献2: Lohmann, V.等人，Science.，285 110-113，1999非专利文献3: Pietschmann, T.等人，J.Virol.，76: 4008-4021，2002非专利文献4: Wakita, T.等人，Nat.Med.，11: 791-796，2005非专利文献5: Lindenbach, B.D.等人，Science，309 623-626，2005非专利文献6: MinKyung, Y.等人，J.Virol.，81: 629-638，2007非专利文献7: Gottwein, JM 等人，Gastroenterology 133 1614-1626，2007非专利文献8 Pietschmann, T.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A., 103 7408-7413， 200
技术实现思路
专利技术所要解决的课题本专利技术的目的在于提供高效制作具有属于基因型la、Ib或2a的JFH-I株以外 的HCV株的结构蛋白的HCV颗粒的方法、以及使用所制作的HCV颗粒的疫苗等。解决课题的方法本专利技术人等为了解决上述课题进行了深入研究，对HCV颗粒在细胞培养中的生 产性进行了研究，发现了HCV增殖时出现的适应性突变(adaptivemutation)。明确了 通 过导入该适应性突变，与突变导入前的野生型相比，可以显著提高HCV颗粒的生产性， 利用持续感染系统可以制作具有属于基因型la、Ib或2a的HCV株的结构蛋白的HCV颗 粒，从而完成了本专利技术。BP,本专利技术涉及以下⑴ (22)。(1)核酸，该核酸含有来自丙型肝炎病毒的嵌合基因，所述嵌合基因是将编码来 自JFH-I株以外的丙型肝炎病毒株的核心蛋白、El蛋白、E2蛋白和p7蛋白、来自上述 JFH-I株或上述JFH-I株以外的丙型肝炎病毒株的NS2蛋白或来自上述JFH-I株的NS2蛋白与来自上述JFH-I株以外的丙型肝炎病毒株的NS2蛋白的嵌合NS2蛋白、以及来自 上述JFH-I株的NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的各区按 照该顺序从5’侧向3’侧配置而形成的，从上述核心蛋白的N末端的氨基酸残基数起，第328位的脯氨酸残基被取代成脯 氨酸残基以外的氨基酸残基。(2)上述(1)所述的核酸，其中，在编码上述核心蛋白的区的5’侧含有上述 JFH-I株的5’非翻译区，在编码上述NS5B蛋白的区的3’侧含有上述JFH-I株的3’非翻译区。(3)上述⑴或⑵所述的核酸，其中，上述JFH-I株以外的丙型肝炎病毒株是 属于基因型la、Ib或2a的株。(4)上述(1) (3)中任一项所述的核酸，其中，上述JFH-I株以外的丙型肝炎 病毒株选自TH株、Conl株、Jl株和它们的衍生株。(5)上述(1) (4)中任一项所述的核酸，其中，上述脯氨酸残基以外的氨基酸 残基选自 Ala、本文档来自技高网...
【技术保护点】
核酸，该核酸含有来自丙型肝炎病毒的嵌合基因，所述嵌合基因是将编码来自ＪＦＨ－１株以外的丙型肝炎病毒株的核心蛋白、Ｅ１蛋白、Ｅ２蛋白和ｐ７蛋白、来自上述ＪＦＨ－１株或上述ＪＦＨ－１株以外的丙型肝炎病毒株的ＮＳ２蛋白或来自上述ＪＦＨ－１株的ＮＳ２蛋白与来自上述ＪＦＨ－１株以外的丙型肝炎病毒株的ＮＳ２蛋白的嵌合ＮＳ２蛋白、以及来自上述ＪＦＨ－１株的ＮＳ３蛋白、ＮＳ４Ａ蛋白、ＮＳ４Ｂ蛋白、ＮＳ５Ａ蛋白和ＮＳ５Ｂ蛋白的各区按照该顺序从５’侧向３’侧配置而形成的，从上述核心蛋白的Ｎ末端的氨基酸残基数起，第３２８位的脯氨酸残基被取代成脯氨酸残基以外的氨基酸残基。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】JP 2008-4-25 2008-1161931.核酸，该核酸含有来自丙型肝炎病毒的嵌合基因，所述嵌合基因是将编码来自 JFH-I株以外的丙型肝炎病毒株的核心蛋白、El蛋白、E2蛋白和p7蛋白、来自上述 JFH-I株或上述JFH-I株以外的丙型肝炎病毒株的NS2蛋白或来自上述JFH-I株的NS2 蛋白与来自上述JFH-I株以外的丙型肝炎病毒株的NS2蛋白的嵌合NS2蛋白、以及来自 上述JFH-I株的NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的各区按 照该顺序从5’侧向3’侧配置而形成的，从上述核心蛋白的N末端的氨基酸残基数起，第328位的脯氨酸残基被取代成脯氨酸 残基以外的氨基酸残基。2.权利要求1所述的核酸，其中，在编码上述核心蛋白的区的5’侧含有上述JFH-I 株的5’非翻译区，在编码上述NS5B蛋白的区的3’侧含有上述JFH-I株的3’非翻译 区。3.权利要求1或2所述的核酸，其中，上述JFH-I株以外的丙型肝炎病毒株是属于基 因型la、Ib或2a的株。4.权利要求1 3中任一项所述的核酸，其中，上述JFH-I株以外的丙型肝炎病毒株 选自TH株、Conl株、Jl株和它们的衍生株。5.权利要求1 4中任一项所述的核酸，其中，上述脯氨酸残基以外的氨基酸残基选 自 Ala、Leu、lie、VaL Thr 和 Ser。6.权利要求1 5中任一项所述的核酸，其中，上述核酸是包含序...
【专利技术属性】
技术研发人员：赤泽大辅，胁田隆字，
申请(专利权)人：东丽株式会社，日本国立感染症研究所，财团法人东京都医学研究机构，
类型：发明
国别省市：JP
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