本发明专利技术提供编码艾美球虫表面抗原的ＤＮＡ顺序、含有这些ＤＮＡ顺序的重组载体、含有这些载体的转化宿主生物、以及利用转化的微生物制备抗原的方法。还提供了用艾美球虫表面抗原预防家禽球虫病的方法。施用这些表面抗原进行预防时，该抗原可以是纯化的蛋白，也可以是编码这些蛋白的ＤＮＡ形式，该ＤＮＡ位于合适的病毒载体如牛痘病毒中。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】球虫病是一种由细胞内的艾美球虫属(Eimeria)原生动物寄生虫引起的家禽疾病。这种疾病是大型密集家禽繁殖场中的一种地方性疾病。据估计，光是在美国，每年用化疗法防治这种疾病的费用就超过1亿美元。由于对抗球虫药物产生抗性，因而要不断开发新的药剂，但现在药物的开发所需的费用越来越高，消费者对食用家畜体内残留药物的接受程度也越来越低。现已有很多文献描述了对天然球虫病感染的保护性免疫。现已证明，在受控条件下每天服用少量活的卵囊，几星期后便可对通常毒性剂量的侵染产生完全的免疫(Rose et al，Parasitology 7325，1976；Rose et al，Parasitology 88199，1984)。对感染具有获得性抗性表明有可能建立一种疫苗而在雏鸡体内诱导免疫，从而无需采用化学抑球虫剂。事实上，这样一种想法已经用Coccivac制剂(SterwinLaboratories，Opelika，Alabama，U.S.A)进行了验证。为了生产球虫病疫苗，Murray等人(欧洲专利申请公告167.443)从禽艾美球虫的子孢子或形成孢子的卵囊中制备了各种提取液，这些提取液中至少含有15种多肽，其中许多多肽都连结在子孢子表面。将这些提取液注射到小鸡体内，则在用形成孢子的毒性禽艾美球虫卵囊口服接种后盲肠损伤减轻。最近，Schenkel等人(美国专利4,650,676)公开了抗禽艾美球虫裂殖子的单克隆抗体的制备方法。利用这些抗体，Schenkel等人鉴定出了这些抗体所针对的多种抗原。Schenkel等人将禽艾美球虫子孢子与这些抗体一起预保温，然后把这些经过处理的子孢子引入小鸡的盲肠，证明盲肠损伤程度与未经处理的子孢子对照相比有所减轻。重组DNA技术的进展提供了另一种可能的途径，即亚单位疫苗。在应用现有的重组DNA方法时，是将特异的DNA顺序插入一个适当的DNA载体中。形成能在宿主细胞内复制的重组DNA分子。常常用称为质粒的环状双链DNA分子作载体。制备这种形式的重组DNA，必须使用能够在特异的碱基顺序位点切割DNA的限制性核酸内切酶。用限制酶在质粒和所要插入的外源DNA片段中进行切割后，就可以用一种称为连接酶的酶把这两个DNA分子共价连接起来。制备这类重组DNA分子的一般方法已有叙述(Cohen等人，美国专利4,237,224；Collins等人，美国专利4,304,863；Maniatis et al，Molecular CloningA LaboratoryManual，1982，Cold Spring Harbor Laboratory)。因为这些参考文献在很大程度上说明了本领域的技术状态，所以在此列为参考文献。制备出重组DNA分子后，只有满足若干条件才能用这些分子来产生由插入的基因顺序确定的产物。最重要的条件是，该重组分子应与宿主细胞相容，并因而能在宿主细胞中自主复制。最近的许多工作利用了大肠杆菌作为宿主细胞，因为它与广泛围的重组质粒相容。根据所用的载体/宿主细胞系统，将重组DNA分子引入宿主的方法可以是转化、转导和转染。对宿主细胞中是否存在重组质粒的检测，可以方便地利用质粒标记活性(如抗生素抗性)来进行。例如，可以通过在含氨苄青霉素的培养基中培养宿主细胞，从未转化的细胞中选择出携有编码氨苄青霉素降解酶的质粒的宿主细胞。还可以利用两个抗生素抗性标记，使质粒在某个位点编码第二种抗生素降解活性，而所选用的限制性核酸内切酶能切割该位点，从而插入外源基因顺序。这样，含有正确重组质粒的宿主细胞就能通过对第一种抗生素有抗性，而对第二种抗生素敏感来鉴定。只是将重组质粒插入宿主细胞并分离出转化的宿主细胞，这本身并不能保证能产生大量的所需基因产物。为此，必须将外源基因顺序与一个称为启动子的信号区以正确的相互关系相融合才能进行DNA的转录。此外，外源DNA也可以带有其自身的启动子，只要它能被宿主细胞识别就行。无论来源如何，启动子都是一段DNA顺序，该顺序指导RNA聚合酶的结合，从而“启动”DNA转录出信使RNA(mRNA)。如果有了能产生大量mRNA的强启动作用，则最终产生的所需基因产物将取决于从mRNA翻译成蛋白质的有效性，而这一过程又取决于核糖体与mRNA结合的效率。在大肠杆菌中，mRNA上的核糖体结合位点包括一个起始密码子(AUG)和一个上游的Shine-Dalgarno(SD)顺序。此顺序含有3～9个核苷酸，位于从AUG密码子算起3～11个核苷酸处。该顺序与大肠杆菌16S核糖体RNA(rRNA)的分端互补(Shine and Dalgarno，Nature 25434，1975)。显然，mRNA中的SD顺序与16SrRNA3′端顺序之间的碱基配对，有利于核糖体与mRNA的结合。有关增强基因表达的综述见Roberts and Lauer，Methods in Enzymology 68473，1979。基于LacZ操纵子与λ噬菌体载体的结合建立了另一种表达系统(Huynh et al，in DNA Cloningvolume I，D.M.Glover，Ed)。在此系统中，β-半乳糖苷酶的结构基因与控制其表达的可诱导性启动子一起被插入到噬菌体载体中。只要在β-半乳糖苷酶基因3′端的独特克隆位点插入含有蛋白编码区的mRNA的cDNA拷贝或基因组DNA片段，就会导致基因融合。β-半乳糖苷酶基因的表达导致一种融合蛋白的生成该蛋白含有114kd的β-半乳糖苷酶和一个由cDNA插入片段编码的羧基末端多肽，但条件是该插入片段含有一个取向(register)与β-半乳糖苷酶读码相同的开放读码。这样，在利用β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)使LacZ阻遏蛋白失活而诱导融合蛋白的表达后，通过基因文库的免疫筛选能够鉴定出一种噬菌体，该噬菌体含有一种基因其产物能被单克隆或多克隆抗血清识别。这一表达载体系统结合了噬菌体系统在包装DNA并将其引入大肠杆菌细胞过程中的高效率和多肽与β-半乳糖苷酶融合体的高稳定性。疫苗亚单位途径是将完整感染性生物的一个亚单位以免疫相关状态输入到宿主动物体内。该亚单位可以是一种由寄生虫纯化出的蛋白、一种在杂合系统中表达的重组蛋白或蛋白片段、一种含有单个中和决定簇的合成肽、或一种由病毒载体(如牛痘)引入的蛋白。宿主的免疫系统无需接触过完整寄生虫就能对该亚单位产生一个特异反应。在受到有毒剂量的感染性生物侵袭时，宿主的免疫系统只需受到它以前曾接触过的疫苗亚单位的指导，便能产生有效的防护。在文献中可以找到循环抗体、小肠上皮中的分泌性IgA(Davis etal，Immunology 34879，1978)和细胞介导的免疫系统(Giambroniet al，Poultry Science 5938，1980)参与对球虫病的获得性抗性的证据。综述见P.S.Davis in Avian Immunology，M.E.Rose，Ed.，British Poultry Science，Ltd.，Edenberg，361-385，1981。免疫系统的各种防护机制的可能参与，意味着要达到完全的、持续的保护作用，可能需要模拟天然感染过程的各个特殊方面的能力。这些方面包括在需要进行保护的位点的局部接触、诱发对起主导作用的抗本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于对家禽进行抗球虫病免疫的疫苗的制备方法，该方法包括，将一种蛋白与一种药学上可接受的载体混合，所述蛋白具有图１５、１７、１９或２１所示的氨基酸顺序之一或是其功能等价物。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：沃纳阿尔滕贝格，玛丽海伦宾格，理查德安东尼奇宗奈特，理查德艾伦克兰马，彼得托马斯隆梅迪科，斯蒂芬J麦安德鲁，
申请(专利权)人：霍夫曼拉罗奇有限公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]
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