一种ＩＣＡＭ１基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种ＩＣＡＭ１细胞间黏着分子－１（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ａｄｈｅｓｉｏｎｍｏｌｅｃｕｌｅ－１，ＩＣＡＭ－１，ＣＤ－５４）基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１所示。本发明专利技术还提供了一种ＩＣＡＭ１基因原位杂交检测方法。另外，本发明专利技术还提供了试剂盒在制备检测癌症早期转移、复发疾病药物中的应用。本发明专利技术优点在于：本发明专利技术提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点。本发明专利技术的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。

【技术实现步骤摘要】
一种ICAM1基因的原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用
本专利技术涉及一种试剂盒，具体地说关于一种ICAMl基因的原位杂交检测试剂盒及 其检测方法和应用
技术介绍
2005年美国卫生研究院、癌症研究院、疾控中心等多家单位做了一个年度报告， “认为人类在抗癌大战中是失败”，也就是说癌症死亡率没有降低，其列举出造成抗癌大战 失败的几个因素是1、肿瘤细胞异质性；2、肿瘤细胞耐药性；3、抗癌药物设计思路不完善 等。同时，该报告中亦提出应重新审视现有诊治癌症的措施。本专利技术人在研究中发现，导致 癌症死亡率不降的另二个重要原因是1、不能做到真正的早期诊断；2、转移的病理机制不 清楚。依照传统的医学影像及和其它生化(如蛋白标记物)指标来诊断癌症，认为占位性 癌块在2公分下是属于早期癌症的诊断(更小些有时无症状体征)，这一临床概念值得认 真讨论。影像医学的2公分以下癌块属早期这一界定科学性是不够严谨的，从细胞学角度， 1公分的肿块约有一亿个肿瘤细胞，2公分的肿块其三维空间的细胞叠加数远不止2亿个肿 瘤细胞，从癌变前期到单克隆癌细胞产生及形成2公分的癌块，其病理演变过程相当长，可 能是一年或两年、甚至三年以上，很难证实的是在这个过程中，肿块是癌症唯一的发生地和 单独的病灶。临床上已证实一旦形成肿块的同时，其他癌细胞通过不同途径迁移到其他 部位克隆生长；一旦切除原发灶后，其他器官复发灶或多发癌块灶先后形成或转移。因此， 在临床上以2公分以下的肿块大小来界定早期与否，不够严谨(有些病例，在发现原发病灶 时，同时发现转移病灶，不在我们表述的内容中)，这时已经是晚期了，这是导致癌症死亡率 不降的真正原因。免疫球蛋白超家族包括ICAM-I、ICAM-2、VCAM-I和N-CAM。细胞间黏着分子 !(intracellular adhesion molecule-1，ICAM-1，CD-54)，介导细胞之间、细胞与基质之 间的黏着性。ICAM-I的表达与HCC的侵袭转移潜能密切相关。血管内皮细胞间黏着分 子1可能参与协助肿瘤细胞逸出循环脉管，进入继发器官，增大转移的概率。文献报道， VCAM-I与胃癌侵袭及淋巴结转移密切相关，神经细胞黏着分子(neural cell adhesion molecular, N-CAM)可能起到传导信息、调控细胞生长的作用，它的丢失有可能使细胞的生 长失控。Li等研究发现N-CAM，与进展期胰腺癌的神经侵犯相关。Sim等系统地研究了肝 细胞癌患者组织、血清以及人肝癌高转移裸鼠模型中细胞黏着分子l(ICAM-l)mRNA及蛋 白水平的表达，提出组织及血清中ICAM-I可提示肝癌的侵袭转移潜能。高水平Sicam-I 常见于多发性肿瘤、伴肝内播散的肝细胞癌，其预后较差。晚期肝细胞癌患者Sicam-I水 平明显高于早期患者，检测ICAM-I水平有助于预测肝癌术后复发，尤其对AFP阴的患者。 这种现象同样见于胃癌、结肠癌、胆囊癌、胰腺癌、肺癌和食管癌等，而且ICAM-I水平与肿 瘤大小成正比，低者ICAM-I的生存率高于高ICAM-I者。ICAMl基因，LOCUS，NM_000201, 3249bpmRNA. 19pl3. 3_pl3. 2，cds :320…1918bp。随着分子生物技术日益完善，功能基因组学，癌症基因组学等研究的深入展开，至 今，我们已有可能在基因水平上做更精确的早期诊断，在癌变前期或癌细胞形成(单克隆 时)就能做到早期预测诊断。本专利技术核酸原位杂交技术检测ICAM-I基因，对消化道等(特 别是肝癌)转移、侵袭有非常重要的临床意义。原位杂交技术(in situ hybridization)是将分子生物学与细胞化学技术结合起 来，以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位检测特异性核酸分子的技术。其原理是使含 有特异序列、经过标记的核酸单链(即探针)，在适宜条件下与组织细胞中的互补核酸单链 即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在细 胞原位显示特异的DNA或RNA分子。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，提供一种ICAMl基因的原位杂交检测试 剂盒的用途。本专利技术的再一的目的是，提供一种ICAMl基因的原位杂交检测试剂盒。本专利技术的另一的目的是，提供一种ICAMl基因的原位杂交检测方法。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案是一种ICAMl基因的原位杂交检测试剂盒在制备检测癌症早期转移、复发疾病药物 中的应用，所述的试剂盒包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO. 1所示。所述的癌症是肝癌、胃癌、结肠癌、胆囊癌、胰腺癌、肺癌或食管癌。所述的杂交探针序列如SEQ ID NO. 1所示的RNA序列。所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。所述的放射性核素选自3H、35S、125I或32P中的一种。所述的非放射性标记物选自生物素、地高辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶或荧光素 中的一种。所述的非放射性标记物优选自地高辛。所述的试剂盒还包括增效剂，所述的增效剂是碱性磷酸酶抗体。为实现上述第二个目的，本专利技术采取的技术方案是一种ICAMl基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，其中所述的杂交 探针序列如SEQ ID NO. 1所示，所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。为实现上述第三个目的，本专利技术采取的技术方案是一种ICAMl基因的原位杂交检测方法，该方法包括以下步骤a、将试剂盒中的杂交探针与底物中待测RNA接触，形成杂交复合体；b、检测a步骤得到的杂交复合体。本专利技术的诊断试剂盒的组份是由杂交探针，杂交液，显色剂，增效剂等组成。本试 剂盒的核酸杂交原理是分子生物学业内人士均熟知，具体操作步骤是标本处理、预杂交、杂 交、免疫组化染色、镜下进行定量分析、结果报告，其中杂交的具体步骤包括仪器操作1).将待测标本放入反应槽中；2).仪器自动弃去液体，自动加消化液；3).仪器自动弃去液体，自动后固定；4).仪器自动弃去液体，自动预杂交(42°C )；5).仪器自动弃去液体，自动清洗；6).仪器自动弃去液体，自动杂交(42°C )；7).仪器自动弃去液体，自动清洗；8).仪器自动弃去液体，自动与DIG抗体培养(室温)；9).仪器自动弃去液体，自动清洗，显色；10).取出封片镜检。本专利技术优点在于1、本专利技术提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点。2、本专利技术的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。3、本专利技术的诊断试剂盒与临床上其它检测癌胚蛋白标志物，以及影像医学检查有 显著不同。本专利技术可以在基因水平上检测ICAMl基因异常表达，在影像医学检查未发现占 位性癌病灶复发之前，癌症生化指标未产生异常之前，亦未形成肿瘤之前，能及早做到以上 基因表达异常的信息采集，给临床癌症病患一个真正的早期诊断以及治疗后转移复发及早 预测。这样才有可能实施癌症的早期诊断、早期预防、早期治疗，有可能从源头上彻底根治 癌症恶疾。附图说明图1是本专利技术实施例中肝癌转移病人ICAMl基因表达图片。图2是本专利技术实施例中胃癌转移病人ICAMl基因表达图片。图3是本专利技术实施例中结肠癌转移病人ICAMl基因表达图片。图4是本专利技术实施例中胆囊癌转移病人ICAMl基因表本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ＩＣＡＭ１基因的原位杂交检测试剂盒在制备检测癌症早期转移、复发疾病药物中的应用，所述的试剂盒包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１所示。

【技术特征摘要】
一种ICAM1基因的原位杂交检测试剂盒在制备检测癌症早期转移、复发疾病药物中的应用，所述的试剂盒包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的癌症是肝癌、胃癌、结肠癌、胆囊 癌、胰腺癌、肺癌或食管癌。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的杂交探针序列如SEQID NO. 1所 示的RNA序列。4.根据权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于所述的标记物选自放射性核素或 非放射性标记物。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述的放射性核素选自3H、35S、125I或32P 中的一种。6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述的非放射性标记物选自生物素、地高 辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶或荧光素中的一种。7.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：裘建英，张云福，
申请(专利权)人：芮屈生物技术上海有限公司，
类型：发明
国别省市：31