一种添加海藻糖强化2-酮基-L-古龙酸生产强度的方法技术

一种添加海藻糖强化２－酮基－Ｌ－古龙酸生产强度的方法，属于发酵制备维生素Ｃ技术领域。本发明专利技术利用酮古龙酸菌（Ｋｅｔｏｇｕｌｏｎｉｇｅｎｉｕｍ　ｖｕｌｇａｒｅ）与巨大芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）混合菌系为生产菌株，通过在发酵培养基中外源添加１０ｍｍｏｌ.Ｌ↑［－１］海藻糖作为渗透保护剂，促进细胞生长和２－酮基－Ｌ－古龙酸（２－ＫＬＧ）的生产，实现２－ＫＬＧ高效生产。高渗（１０６７．５ｍＯｓｍｏｌ.ｋｇ↑［－１］）条件下添加１０ｍｍｏｌ.Ｌ↑［－１］海藻糖，２－ＫＬＧ含量在７２ｈ时为５６．８３ｇ.Ｌ↑［－１］，为对照组（高渗条件下不加海藻糖）２９．２４ｇ.Ｌ↑［－１］的１．９４倍。正常发酵（不加ＮａＣｌ）条件下添加１０ｍｍｏｌ.Ｌ↑［－１］海藻糖，发酵周期缩短至５２ｈ，终点产酸达到６９．３８ｇ.Ｌ↑［－１］，Ｌ－山梨糖消耗速度和２－ＫＬＧ生产强度分别提高了４３．１％和４５．５％。

【技术实现步骤摘要】

一种添加海藻糖强化2-酮基-L-古龙酸生产强度的方法，属于发酵制备维生 素C

技术介绍
维生素C (即L-抗坏血酸)是人体必需的一种维生素，生理作用广泛，在 医药、食品工业上均有重要用途，在整个维生素类药物生产中占有十分重要的 地位。目前我国维生素C生产主要采用"二步发酵法"。该工艺的主要特点在于 第二步发酵，即从L-山梨糖到2-酮基-L-古龙酸(2-KLG)的转化需要由酮古龙酸 菌(Xetogw/o"/gem'譜vw/gare，通禾尔"小菌")与巨大芽抱杆菌(Sat"'〃w megafm'wm, 通称"大菌")搭配而成的组合菌系进行混合发酵。虽然"二步发酵法"以微生物发酵代替了化学合成法，简化了工艺，减少 了污染，降低了成本，但现在仍未完全发挥其潜在的生产能力。比如，工业发 酵过程中的补糖以及为维持pH稳定所采取的补碱措施都会引起培养体系渗透 压的上升，从而抑制组合菌系的产酸能力。因此，提高菌株对高渗的耐受能力， 从而加强2-KLG的生产强度是非常有必要的。海藻糖是一种独特的非还原性二糖，能够作为相容性溶质使受渗透胁迫的 细胞保持稳定。此外，在其它环境胁迫下，如热胁迫、脱水、缺氧等，也常常 涉及海藻糖的积累来提高细胞的生存能力。因此，海藻糖是一种优良的胁迫保 护剂。目前，添加海藻糖提高混合菌系对高渗的耐受能力，从而加强2-KLG的 生产强度尚未见文献报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种添加海藻糖作为渗透保护剂，促进酮古龙酸菌 (A^togw/ow/g^n'w附vw/garg)与巨大芽抱杆菌08" '//"1 wgg"fer/ww)混合菌系细胞生 长和2-KLG生产，加强2-KLG生产强度，縮短发酵周期的方法。1、 菌株酮古龙酸菌CS^ogw/ow/gem'w附vw/gaw) DSM 4025及巨大芽孢杆菌(5a"7/^ megafen'wm)ATCC 21916，由江苏江山制药有限公司(江苏靖江)提供。2、 培养基和培养方法种子培养基(g丄")L-山梨糖20，酵母膏3，牛肉膏3，大豆蛋白胨10， 玉米浆1.5,尿素1， KH2P041， MgS042， CaC03l。发酵培养基(g丄")L-山梨糖80，玉米浆5，尿素12， KH2P041， MgS04l， CaC03 5。 NaCl作为渗透压调节剂，根据要求适量添加。渗透保护剂 海藻糖添加浓度为lOmmol，L'1。3所有培养基由自来水配置并用2 molvL/1 NaOH调节pH为6.7 7.0。 L-山梨 糖和氮源分开灭菌，灭菌条件为12rC, 15min。3、 大菌与小菌混合菌系的培养用接种环挑取新鲜平板上小菌单菌落两环，再挑取大菌单菌落一环，于无 菌水中制成混菌悬液，取混菌悬液涂斜面，30'C培养48h;取斜面混合菌0.4mL 接种于种子培养液75mL/750mL摇瓶中。3(TC， 200 rpm下培养18 h，即制成 大小菌混合菌系，接入甘油管中进行保藏。4、 培养方法从冷冻甘油管中取混菌保藏培养物种液10mL接入发酵培养 基(75 mL/750 mL摇瓶)，30°C， 200rpm培养72h，定期取样测定参数。5、 分析方法菌体浓度测定取适量的菌悬液置于10 mL容量瓶中，加入等体积2 mol-L/1 盐酸溶解菌悬液中的碳酸钙，再加入去离子水定容至10mL，摇匀，用UV7500 型可见分光光度计，于660 nm处比色测OD值。渗透压测定用冰点渗透压计测定。2-KLG与L-山梨糖含量的测定采用高效液相色谱(HPLC)测定。色谱柱 AminexHPX-87H(Bio-Rad)，流动相0.005 mol'L" H2S04，流速O-SmLmin", 柱温35'C，进样量:5^iL，检测器示差折光检测器。本专利技术的有益效果在髙渗(1067.5 mOsmoHcg—"条件下添加10 mmol，L"海 藻糖，2-KLG含量在72 h时为对照组(高渗条件下不加海藻糖)29.23 g丄"的 1.94倍。正常发酵(不加NaCl)时添加10mmol丄"海藻糖，发酵周期縮短到52h， 终点产酸达到69.38 g丄"，L-山梨糖消耗速度和2-KLG生产强度分别提高了 43.1%和45.5%。 具体实施例方式对照实施例本专利技术所用的菌种为酮古龙酸菌(i^ogM/ow扭W蘭v^gwe)与 巨大芽孢杆菌(5a" /w mega m'"w)混合菌系。从冷冻甘油管中取混菌保藏培养 物0.4mL接入种子培养基(75mL/750mL摇瓶)，30°C， 200rpm培养18h。再 取种液10 mL接入发酵培养基(75 mL/750 mL摇瓶)，30°C ， 200 rpm培养72 h。 正常发酵(652.5 10311101'1^-1，不加NaCl)时，终点2-KLG和L-山梨糖浓度分别 为66.04 g丄"，7.58 g丄"。高渗(1067.5 mOsmol'kg",加NaCl)条件下，终点2-KLG 浓度为29.24 g-L—1。实施例1:在正常发酵(652.5 mOsmol'kg—1，不加NaCl)和高渗胁迫(1067.5 mOsmoHcg'1，加NaCl)发酵培养基中分别添加10 mmol'U1海藻糖，其余条件同 对照实施例。正常发酵(652.5 mOsmol'kg"，不加NaCl)条件下添加10 mmol-U1 海藻糖，52 h时2-KLG与L-山梨糖浓度分别为69.38 g七"，3.33 g七"。高渗(1067.5 mOsmol'kg'1，加NaCl)条件下添加10 mmol'L"海藻糖，72 h时2-KLG浓度为 56.83 g.1/1。权利要求1、一种添加海藻糖强化2-酮基-L-古龙酸生产强度的方法，其特征是利用酮古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare)与巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)混合菌系为生产菌株，发酵生产维生素C前体2-酮基-L-古龙酸，通过在发酵培养基中添加海藻糖10mmol·L-1，在过程中作为渗透保护剂，提高耐高渗能力，促进细胞生长和2-酮基-L-古龙酸的生产，实现2-酮基-L-古龙酸高效生产。全文摘要一种添加海藻糖强化2-酮基-L-古龙酸生产强度的方法，属于发酵制备维生素C
本专利技术利用酮古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare)与巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)混合菌系为生产菌株，通过在发酵培养基中外源添加10mmol·L^-1海藻糖作为渗透保护剂，促进细胞生长和2-酮基-L-古龙酸(2-KLG)的生产，实现2-KLG高效生产。高渗(1067.5mOsmol·kg^-1)条件下添加10mmol·L^-1海藻糖，2-KLG含量在72h时为56.83g·L^-1，为对照组(高渗条件下不加海藻糖)29.24g·L^-1的1.94倍。正常发酵(不加NaCl)条件下添加10mmol·L<sup>-1</s本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种添加海藻糖强化２－酮基－Ｌ－古龙酸生产强度的方法，其特征是利用酮古龙酸菌（Ｋｅｔｏｇｕｌｏｎｉｇｅｎｉｕｍ　ｖｕｌｇａｒｅ）与巨大芽孢杆菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）混合菌系为生产菌株，发酵生产维生素Ｃ前体２－酮基－Ｌ－古龙酸，通过在发酵培养基中添加海藻糖１０ｍｍｏｌ.Ｌ↑［－１］，在过程中作为渗透保护剂，提高耐高渗能力，促进细胞生长和２－酮基－Ｌ－古龙酸的生产，实现２－酮基－Ｌ－古龙酸高效生产。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘立明，陈克杰，周景文，陈坚，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：32[]