一种基于ERA-CRISPR/Cas12a技术的非洲猪瘟便携式检测方法技术

本发明专利技术涉及动物疫病检测技术领域，具体为一种基于ERA‑CRISPR/Cas12a技术的非洲猪瘟便携式检测方法，通过特殊设计的双层反应管实现ERA恒温核酸扩增与CRISPR/Cas12a检测的时空分离，配套150g便携式恒温核酸扩增分析仪，可在45℃下30分钟内完成检测。该方法以非洲猪瘟病毒B646L基因为靶标，利用crRNA与Cas12a蛋白识别靶序列激活荧光信号，检测灵敏度达12.1拷贝/μL，对PRRSV、PRV等常见猪病原体无交叉反应。仪器支持蓝牙连接手机实时显示荧光曲线，可通过阈值自动判定或紫外光肉眼观察结果，解决了现有技术设备昂贵、操作复杂的问题，适用于现场快速检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及动物疫病检测，具体为一种基于era-crispr/cas12a技术的非洲猪瘟便携式检测方法。

技术介绍

1、非洲猪瘟(asf)是由非洲猪瘟病毒(asfv)引起的高致死性传染病，自2018年传入中国后，给养猪业造成巨大经济损失。目前asfv检测方法主要包括：病原学检测、核酸检测和血清学检测。病原学检测主要是将病毒分离培养作为“金标准”，需在三级生物安全实验室操作，检测周期长(通常需5-7天)，无法满足现场快速诊断需求。核酸检测采用常规pcr、实时荧光定量pcr(qpcr)、液滴数字pcr(ddpcr)等技术，虽然灵敏度高，但qpcr需专业仪器(如荧光定量pcr仪)，ddpcr设备成本高达数十万元，且操作需专业人员。以及血清学检测的elisa技术虽然应用广泛，但存在检测窗口期长(感染后7-14天才能检出抗体)、无法区分野毒与疫苗株等局限性。

2、现有检测技术需实验室级别的昂贵仪器(如pcr仪、荧光检测仪)，难以在野外场景使用。并且qpcr等技术需严格的温度循环控制、引物设计和荧光探针配置，非专业人员难以掌握。而传统pcr流程(核酸提取本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种基于ERA-CRISPR/Cas12a技术的非洲猪瘟便携式检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种基于ERA-CRISPR/Cas12a技术的非洲猪瘟便携式检测方法，其特征在于：所述ERA反应的靶基因是非洲猪瘟病毒的B646L基因。

3.根据权利要求1所述的一种基于ERA-CRISPR/Cas12a技术的非洲猪瘟便携式检测方法，其特征在于：所述CRISPR/Cas12a系统还包含末端标记有6-FAM荧光团和BHQ1淬灭剂的单链DNA报告分子，用于监测CRISPR/Cas12a的识别事件。

4.根据权利要求1所述的一种基...

【技术特征摘要】

1.一种基于era-crispr/cas12a技术的非洲猪瘟便携式检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种基于era-crispr/cas12a技术的非洲猪瘟便携式检测方法，其特征在于：所述era反应的靶基因是非洲猪瘟病毒的b646l基因。

3.根据权利要求1所述的一种基于era-crispr/cas12a技术的非洲猪瘟便携式检测方法，其特征在于：所述crispr/cas12a系统还包含末端标记有6-fam荧光团和bhq1淬灭剂的单链dna报告分子，用于监测crispr/cas12a的识别事件。

4.根据权利要求1所述的一种基于era-crispr/cas12a技术的非洲猪瘟便携式检测方法，其特征在于：所述恒温核酸扩增分析仪的重量为150g，可同时检测4个样品，每12秒检测一次fam光源。

5.根据权利要求1所述的一种基于era-crispr/cas12a技术的非洲猪瘟便携式检测方法，其特征在于：所述反应管下层进行era反应的温度为45℃，反应时间为15分钟。

6.根据权利要求1所述的一种基于era-crispr/cas12a技术的非洲猪瘟便携式检...

【专利技术属性】
技术研发人员：费中杰，许立伟，姜平，白娟，王晓明，高雁怩，王思懿，杨燚彬，满孟丽，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：