一种基于CRISPR-Cas9系统的人源EpCAM基因敲除载体及其细胞株技术方案

本发明专利技术公开了3种基于CRISPR‑Cas9系统的人源EpCAM基因敲除载体及其细胞株，属于基因工程和生物技术领域。将基于EpCAM基因设计的3对sgRNA（sgRNA‑1和sgRNA‑2、sgRNA‑3和sgRNA‑4、sgRNA‑5和sgRNA‑6），在每个sgRNA前面加上U6 promoter，每对之间以T2A链接，每对分别连接到pGMC00010载体骨架结构上，得到3种EpCAM基因的敲除载体pGMC‑KO‑EpCAM‑1、pGMC‑KO‑EpCAM‑2、pGMC‑KO‑EpCAM‑3。将这三种重组质粒分别转化到大肠杆菌DH5α中，得到重组微生物。通过转染试剂Lipo2000，将上述基因敲除载体分别转染HRT‑18细胞，用嘌呤霉素筛选单克隆的方法获得阳性细胞株，最后用流式细胞术分析筛选获得转基因细胞HRT‑18‑KO‑EpCAM‑2以及HRT‑18‑KO‑EpCAM‑3细胞株。本发明专利技术构建了敲除EpCAM基因的载体，进而构建其相应低表达EpCAM基因的结直肠癌细胞株，对于EpCAM与结直肠癌发生、发展的分子机制的研究十分重要。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及3种基于crispr-cas9系统的人源epcam基因敲除载体及其细胞株，属于基因工程和生物。

技术介绍

1、结直肠癌早期最常用的治疗方法以手术切除癌肿，同时结合一些辅助疗法，但晚期则相反，手术仅作为对患者的姑息治疗方法，或是仅用于消除对患者影响较大的症状。随着医学的发展，靶向治疗和免疫治疗在结直肠癌治疗中的地位日益凸显。

2、上皮特异性黏附分子（epcam）是一个大小为 40k d 的 i 型跨膜糖蛋白，作为结直肠癌特异性抗原的同时，其也是一种肿瘤干细胞抗原。epcam作为一种细胞黏附分子，参与细胞间的黏附和连接，对维持组织的完整性和功能具有重要作用。在结直肠癌中，epcam的异常表达可能导致细胞间黏附力减弱，促进肿瘤细胞的侵袭和转移。此外，epcam还可能通过影响细胞增殖、凋亡等生物学过程，参与结直肠癌的发生和发展。总之，epcam与结直肠癌之间存在密切的关系。epcam在结直肠癌中的高表达与肿瘤的恶性程度呈正相关，且其异常表达可能促进肿瘤细胞的侵袭和转移。

3、关于epcam与结直肠癌的分子机制，尽管已有一些研究本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种真核生物基因敲除载体，其特征在于，将基于EpCAM基因设计的3对sgRNA（sgRNA-1和sgRNA-2、sgRNA-3和sgRNA-4、sgRNA-5和sgRNA-6），在每个sgRNA前面加上U6promoter启动子，每对之间以T2A链接，最后分别连接到pGMC00010空载体骨架结构上，得到3种EpCAM基因的敲除载体pGMC-KO-EpCAM-1、pGMC-KO-EpCAM-2、pGMC-KO-EpCAM-3；所述基于EpCAM基因设计的U6 promoter + sgRNA-1 + T2A + U6 promoter + sgRNA-2的核苷酸序列如SEQ ID N...

【技术特征摘要】

1.一种真核生物基因敲除载体，其特征在于，将基于epcam基因设计的3对sgrna（sgrna-1和sgrna-2、sgrna-3和sgrna-4、sgrna-5和sgrna-6），在每个sgrna前面加上u6promoter启动子，每对之间以t2a链接，最后分别连接到pgmc00010空载体骨架结构上，得到3种epcam基因的敲除载体pgmc-ko-epcam-1、pgmc-ko-epcam-2、pgmc-ko-epcam-3；所述基于epcam基因设计的u6 promoter + sgrna-1 + t2a + u6 promoter + sgrna-2的核苷酸序列如seq id no .1所示，所述基于epcam基因设计的u6 promoter + sgrna-3 + t2a +u6 promoter + sgrna-4的核苷酸序列如seq id no .2所示，所述基于epcam基因设计的u6promoter + sgrna-5 + t2a + u6 promoter + sgrna-6的核苷酸序列如seq id no .3所示，所述pgmc00010空载体的核苷酸序列如seq id no .4所示。

2.如权利要求1所述的3种epcam基因的敲除载体，其特征在于，将所述基于epcam基因设计的3对sgrna分别连接到空载体pgmc00010的多克隆位点not1和ecor1之间，在u6promoter启动子的驱动下高水平表达。

3.如权利要求1所述的3种epcam基因的敲除载体，其特征在于，该载体上含有cas9基因结构以及转基因细胞筛选的标记基因rfp基因结构和puro基因结构在ef...

【专利技术属性】
技术研发人员：王丙萍，段金凯，
申请(专利权)人：王丙萍，
类型：发明
国别省市：