一种DNA嵌合体制备及其应用方法技术

本发明专利技术涉及生物化学技术领域，公开了一种DNA嵌合体制备及其应用方法，包括以下步骤：合成磷酸化线性环形L‑rTDNA与模板DNA，按等摩尔浓度10μM混合于1×T4DNA连接酶缓冲液中，经95℃加热5分钟后120分钟梯度降温冷却至室温复性；加入T4DNA连接酶封闭末端缺口，经酶切处理后获得环状rTDNA；合成发卡DNAHP，将rTDNA与HP按等摩尔浓度2μmol/L混合，经95℃变性5分钟后2小时缓慢降温降至25℃，自组装成DNA拓扑受限嵌合体。本发明专利技术构建具有动态响应能力的DNA嵌合体，实现“免酶组装‑靶标触发‑信号级联放大”的一体化检测流程，同时解决复杂基质中的抗干扰与超灵敏检测问题。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物化学，具体涉及一种dna嵌合体制备及其应用方法。

技术介绍

1、微小rna（mirna）作为基因表达调控的关键分子，其异常表达与多种疾病（如癌症、脓毒症）的发生发展密切相关。外泌体包裹的mirna因受脂质双层保护，稳定性高且能反映源细胞状态，成为极具潜力的无创诊断生物标志物。然而，外泌体mirna的微量特性（通常低至fm级）与临床样本的复杂基质（如血清中的蛋白酶、rnase及非特异性核酸），对检测技术的灵敏度、特异性及抗干扰能力提出了极高要求。

2、当前dna嵌合体的制备与应用方法主要围绕核酸分子动态组装与信号放大展开，代表性技术包括：

3、1、链置换反应（sdr）体系：通过设计多组dna探针（如专利cn113293199a的探针a-e），利用级联链置换反应实现信号放大，无需酶参与即可在等温条件下完成检测；

4、2、滚环扩增（rca）技术：基于锁式探针环化后启动rca，结合二次扩增（如专利cn105463110a的环介导等温扩增）提升信号强度，但需依赖限制性内切酶处理扩增产物；>

5、3、荧光本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种DNA嵌合体制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的DNA嵌合体制备方法，其特征在于，步骤二中的酶切处理步骤包括：70℃加热5分钟灭活连接酶后，加入核酸外切酶III与核酸外切酶I，37℃反应60分钟降解未闭合线性DNA，再经80℃加热15分钟灭活外切酶。

3.根据权利要求1所述的DNA嵌合体制备方法，其特征在于，所述DNA嵌合体的结构参数优化包括：设计环-发夹连接区碱基数目为5-24nt、miRNA识别区立足点碱基数目为5-30nt的系列嵌合体，通过12%非变性PAGE电泳筛选构象稳定的目标产物。

4.根据权利要求3所述的...

【技术特征摘要】

1.一种dna嵌合体制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的dna嵌合体制备方法，其特征在于，步骤二中的酶切处理步骤包括：70℃加热5分钟灭活连接酶后，加入核酸外切酶iii与核酸外切酶i，37℃反应60分钟降解未闭合线性dna，再经80℃加热15分钟灭活外切酶。

3.根据权利要求1所述的dna嵌合体制备方法，其特征在于，所述dna嵌合体的结构参数优化包括：设计环-发夹连接区碱基数目为5-24nt、mirna识别区立足点碱基数目为5-30nt的系列嵌合体，通过12%非变性page电泳筛选构象稳定的目标产物。

4.根据权利要求3所述的dna嵌合体制备方法，其特征在于，所述筛选构象稳定的条件为：电泳迁移率单一清晰条带，且荧光检测显示滚环扩增特异性信号与背景信号比值＞10:1。

5.根据权利要求1所述的dna嵌合体制备方法，其特征在于，步骤三中自组装过程的缓慢降温程序为：95℃变性后，先在30分钟内冷却至65℃，再在40分钟内冷却至25℃。

6.根据权利要求1所述的dna嵌合体制备方法，其特征在于，还包括嵌合体纯化步骤：通过12%非变...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴茳铃，刘刚，赵钰玫，薛建江，谢维，余荣俊，汪陈星，张琼元，桂宵，王霖黎，毛伟，
申请(专利权)人：重庆医科大学附属大学城医院，
类型：发明
国别省市：