用于心脏病的抗人线粒体腺苷酸激酶同工酶抗体，诊断制剂和诊断试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及利用人线粒体腺苷酸激酶同工酶的用于心脏病的免疫制剂和诊断试剂盒。本发明专利技术提供了用于心脏病的免疫制剂和诊断试剂盒，其特征在于利用了存在于肌肉细胞中的心肌细胞但不存在于骨骼肌细胞中的腺苷酸激酶同工酶作为心脏病的诊断标记，因此能够更正确和容易地诊断心脏病。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
用于心脏病的抗人线粒体腺苷酸激酶同工酶抗体,诊断制剂和诊断试剂盒的制作方法
技术介绍
本专利技术涉及利用人线粒体腺苷酸激酶同工酶的免疫制剂和诊断试剂盒，更具体地说，涉及用于心脏病的免疫制剂和诊断试剂盒，其特征在于利用具有心肌特异性表达的腺苷酸激酶同工酶AK3作为包括心肌梗死、心绞痛等在内的心脏病的诊断标记，由此能够更正确和容易地诊断心脏病而不会造成因极小的诊断区别导致的误诊。
技术介绍
心脏病如急性心肌梗死作为一种成年人疾病主要在40岁以上的人群中发生，发病率超过50％，世界上死于心脏病的患者逐年增加。在国内的综合性医院中为了诊断心脏病每个月要完成平均200或更多的检测。在美国，每年有100多万患胸痛的人进入医院急诊室。过去诊断胸痛病人是否患心脏病的一般方法是利用心电图(ECG或声波术)。用ECG诊断心肌梗死时，通过ECG的异常ST-T波和Q波的改变来确定心肌梗死。但是，50％或更多的进入医院的心肌梗死患者被误诊，约5％的患者被送回家，16％的患者因误诊而导致死亡。为了解决这些问题，开发了心肌梗死的生物学标记物。理想的心肌梗死生物学标记物应符合下列要求。首先，所述标记应仅存在于心肌细胞并随肌细胞的坏死而被释放到血液中。第二，在心肌受损后，所述标记应被迅速释放到血液中，这取决于所述生物学标记的细胞分布和分子大小。第三，心脏受损程度与释放的生物学标记的数量之间应呈线性关系。第四，进行检测不需要特殊的培训和技巧，检测所用试剂的成本应能够持续保持低廉。第五，患者感觉胸痛后，血液中生物化学标记的病理学浓度应增加。第六，释放的生物学标记应能够被迅速取出，以便确定持续的心肌梗死。但是，遗憾的是，目前还没有得到满足上述这些要求的生物学标记。目前，用肌酸激酶(CK)质谱检测和肌钙蛋白检测作为心肌梗死诊断的生物化学标记。CK在肌肉组织中为MM型，在脑和骨髓中为BB型，在骨骼肌或心肌中为杂种MB型，它们的血清浓度作为心脏组织损伤的指标。具体地说，已知CK-MB为一种可以表明急性心肌梗死程度的酶，在所有肌肉疾病例如烧伤、创伤、心脏和骨骼肌疾病中，其血液效能(potency)有约5％的变化幅度。但是，利用CK-MB诊断心肌梗死存在很多限制有约20％的假信号，从而降低了检测精确度，因此不能够作为一种可靠的诊断方法。目前，世界卫生组织(WHO)提出的心肌梗死的诊断标准是(1)传统胸痛，(2)ECG的Q波异常，(3)生物化学标记物应超过参考范围。如果一个患者符合至少上述两项标准，则应将其最终确诊为心肌梗死患者。所述的生物化学标记物应属于诊断急性心肌梗死的急性压塞之症的一部分。另外，Boyce N等开发了一种心脏肌钙蛋白T(cTnT)检测以减少因使用肌酸激酶(CK-MB)作为常规心脏损伤指标而引起的误诊[参考《临床实验室新闻》Clinical Laboratory News，22(1)，1-14(1996)]。美国食品药物管理局(FDA)批准了该检测，并由Boehringer ManheimDiagnostics Co.，Ltd.将其商业化为一种产品。自1996年11月，美国已开始使用该产品，现在使用肌钙蛋白I检测，因为据证实它与骨骼肌衍生的肌钙蛋白T发生交叉反应。但是，cTnT和cTnI都是在胸痛后12-24小时内释放的，因此不能作为早期指标。[参考“Eisenbrey等，(1995)The Journal of American Medical Association，74，1343-1344”]。因此，这些检测不是令人满意的可供选择的检测。因此，它们仅被用作CK-MB检测的辅助方法。仅在少数综合性医院有限地使用所属诊断方法，因为它们需要昂贵的检测装置、心脏专家和受过培训的人员，因此增加了昂贵的诊断成本。此外，需要持续检测的患者很难使用肌钙蛋白，因为在韩国医疗保险仅允许使用一次肌钙蛋白。如上所述，就AMI发作后的诊断精确度和诊断时间而言，现有的用于诊断心脏病的生物学指标不能令人满意。因此，需要一种诊断心肌损伤的新的诊断指标，它能够更精确迅速地诊断而不需要昂贵的检测装置，并且可对小规模临床和个人进行心脏病诊断。本专利技术公开本专利技术的目的是将人线粒体腺苷酸激酶用于诊断心脏病和心肌梗死的能够提供极佳的精确度和灵敏度的免疫制剂和诊断试剂盒，其特征在于能够满足心肌梗死理想生物学标记物所有要求的诊断指标候选物特异性地存在于心肌组织，而且使用具有不同亚细胞分布的并能够特异性识别人线粒体腺苷酸激酶同工酶的抗—AK抗体。也就是说，本专利技术提供一种人线粒体腺苷酸激酶同工酶(AK)的特异性免疫球蛋白和其部分，其特征在于所述免疫球蛋白是用包括人线粒体腺苷酸激酶同工酶(AK)和其部分作为免疫原在动物体内产生的。本专利技术还提供了包括免疫球蛋白和检测标记物的组合在内的免疫制剂。本专利技术还提供了用于心脏病的诊断试剂盒，包括结合检测标记物的本专利技术所述的免疫球蛋白和可药用的载体。本专利技术还提供了在检测样品中检测人线粒体腺苷酸激酶同工酶3(AK3)的方法，该方法包括步骤(a)、(b)和(c)(a)通过分别将检测样品和对照样品与抗腺苷酸激酶同工酶3(AK3)抗体或其部分进行免疫反应，从而产生免疫复合物；(b)检测在所述步骤(a)中得到的免疫复合物；和(c)比较检测样品和对照样品的检测结果。附图简述附图说明图1是说明细胞中腺苷酸激酶同工酶的亚细胞分布的示意图。图2是说明腺苷酸激酶同工酶3(AK3)的PCR产物的电泳图；图3是PCR2.1-AK3的基因图谱。图4是通过特异性限制酶消化的质粒图。图5是限制酶消化图。图6是pQE 30-AK3的基因图谱。图7a是AK3的SDS-PAGE结果图。图7b是AK3 Western印迹分析结果图。图8a是AK1的SDS-PAGE的结果图；图8b是AK1 Western印迹分析结果图；图9a是AK2的SDS-PAGE的结果图；图9b是AK2 Western印迹分析结果图； 图10是抗AK3兔抗体的纯化过程图；图11是AK同工酶的纯化重组体图；图12是纯化的抗AK同工酶抗体间的交叉反应结果图；图13是AK同工酶的组织分布图；图14是在取代或非取代条件下，用心肌梗死患者血清的抗AK2抗体和抗AK3抗体得到的Western印迹分析结果；图15是AK和人血清的天然凝胶电泳迁移图；图16检测患者血清中AK3的Western印迹分析结果图；图17是实施例6中AK3的Western印迹结果图。完成本专利技术的最佳方式以下参考附图详细描述本专利技术的优选实施方案。本文术语“生物学样品”指从人体分离的体液或其部分，例如尿液、血液、血清和血浆。本文术语“检测标记物”指用于检测免疫复合物的标记物，例如放射性同位素标记、金颗粒、酶、化学发光化合物、荧光素、藻胆蛋白、稀土螯合剂、荧光物质例如rodamine、辅酶、生物素、链霉抗生物素蛋白等。本文术语“单克隆”指从一种克隆的杂交瘤细胞系统和能够产生单一种类抗体的系统衍生的免疫球蛋白细胞，所述抗体是通过细胞融合例如杂交瘤细胞系产生的。本文术语“多克隆”指能够产生免疫球蛋白的系统，所述免疫球蛋白衍生于对免疫原有一般多亲和性的多种细胞，其中“免疫球蛋白”通常指在具有所需免疫的动物中合成的免疫球蛋白。本文术语“线粒体腺苷酸激酶同工酶本文档来自技高网...

【技术保护点】
人线粒体腺苷酸激酶同工酶ＡＫ２和ＡＫ３特异性的免疫球蛋白和其部分，其特征在于所述免疫球蛋白是由与包括人线粒体腺苷酸激酶同工酶和其部分的免疫原有反应性的动物种类产生的。

【技术特征摘要】
KR 2000-2-8 2000/58081.人线粒体腺苷酸激酶同工酶AK2和AK3特异性的免疫球蛋白和其部分，其特征在于所述免疫球蛋白是由与包括人线粒体腺苷酸激酶同工酶和其部分的免疫原有反应性的动物种类产生的。2.根据权利要求1的免疫球蛋白，其中从人器官得到的或遗传重组形式得到的所述人线粒体腺苷酸激酶同工酶是人线粒体腺苷酸激酶同工酶2(AK2)或人线粒体腺苷酸激酶同工酶3(AK3)。3.根据权利要求1或2的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋选自IgA、IgG、IgM、IgD、IgE、IgY、Fab、Fab’或F(ab)’2的片段。4.根据权利要求1或2的免疫球蛋白，其中所述动物种类是多克隆的。5.根据权利要求1或2的免疫球蛋白，其中所述动物种类是单克隆的。6.用于诊断心脏病的免疫制剂，由权利要求1的免疫球蛋白和检测标记组成。7.根据权利要求6用于诊断心脏病的免疫制剂，其中所述检测标记选自放射性同位素标记、酶、化学发光化合物、荧光素、藻胆蛋白、稀土螯合剂、荧光物质例如rodamine、辅酶、链霉抗生物素蛋白和生物素。8.用于检测生物样品中腺苷酸激酶同工酶的方法，其中将权利要求6的免疫制剂与生物样品接触以检测所述结合的免疫球蛋白标记。9.根据权利要求6用于检测生物样品中腺苷酸激酶同工酶的方法，其中所述生物样品是尿、血液或从人体分离的血...

【专利技术属性】
技术研发人员：金晓骏，曹基胜，李相旻，
申请(专利权)人：金晓骏，
类型：发明
国别省市：KR[韩国]