用于非侵入性产前诊断的方法和装置制造方法及图纸

用于非侵入的产前诊断的方法，所述方法包括以下步骤：ａ．获得有机流体样品，所述有机流体具有含有来自怀孕妇女的胎儿细胞的高概率；ｂ．使所述有机流体样品富含至少一个包括至少一种类型的胎儿具核细胞的细胞群；ｃ．从所述至少一种类型的胎儿具核细胞中分离至少一个细胞；ｄ．在从所述至少一种类型的胎儿具核细胞中分离的所述至少一个细胞上进行遗传分析，以便突出所述至少一个胎儿具核细胞的至少一种遗传特征，适于容许所述诊断；其中从所述至少一种类型的胎儿具核细胞中分离至少一个细胞的步骤是通过在设计用于所述用途的微型流体装置中单独选择单个细胞而进行的。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于非侵入性产前诊断，特别是用于识别胎儿中的基因和染色体病症的方法。现有技术对于染色体病症的产前诊断是为了突出胎儿中的染色体异常的目的而引入的。迄今，胎儿受染色体病症影响的诊断确定仅能通过侵入性诊断测试而获得，通过羊水穿刺、绒膜绒毛的采样或脐穿刺的方法检查胚胎细胞以确定核型。全部这些测试是侵入性的并且涉及增加的流产风险。因此，它们通常被推荐用于超过35岁的女性，或在以前的怀孕中曾经怀有受染色体病症影响的胎儿的妇女或当超声扫描确定具有畸形的胎儿时。在母体循环中发现胎儿细胞的存在，虽然很少，但是已经引起许多小组研究并且开发用于分离和回收所述细胞的方法，这容许非侵入性产前诊断。具体地，存在三种能通过胎盘屏障的主要胎儿细胞类型:淋巴细胞，营养细胞和成红血细胞。在这些中，研究已经首先针对研究用于分离来自外周母体血液的胎儿成红血细胞和营养细胞，源自胎盘的上皮细胞的方法。从外周血分离营养细胞受它们的多核形态的限制，然而已经证明，在妊娠的第6周和15周之间，经宫颈样品中存在这些细胞。应当注意，从胎盘迁移的营养细胞经常粘合其它营养细胞或母体细胞，形成凝块。最近通过直接应用到非培养的胎儿细胞的分子生物学方法已经使得胎儿细胞的鉴定成为可能。所述方法例如是产前FISH(荧光原位杂交)和定量荧光-聚合酶链式反应(QF-PCR)。QF-PCR是能识别和同时量化染色体特异性的DNA序列的方法，其可适用于单独的细胞，允许了基于非 常低数量胎儿细胞的遗传分析。在文献中，存在许多出版物，包括一些综述，将其内容结合在这里，用于作为涉及QF-PCR在产前分析中应用的所需部分的简单参考。D.ff.Bianchi和同事基于多参数评分开发了 从母体血液分离胎儿具核红细胞(NRBCs)的系统；所述参数包括两种形态学特征(核的圆度和形态)和胎儿血红蛋白标记的两种性质(细胞质的荧光强度和周围发光度)。该流程提供根据密度梯度分离单核细胞和通过消除白细胞的富集(具有关于CD15和CD45的抗体的MACS)和使用利用Y抗-血红蛋白抗体的FACS方法在细胞荧光计上分离。在显微镜观察下，使用显微操作器回收通过多参数评分鉴定的细胞。评分系统是非常费力的，并且使用显微操作器引起部分细胞的损失。通常，该方法已经在回收胎儿细胞方面显示74%的灵敏性，兼有5%的假阳性频率。由其它工作还已知，根据密度梯度分离单核细胞和通过缺少⑶71+细胞的MACS富集样品，其进一步由关于Y和ε胎儿血红蛋白链的特异性抗体标记。然而，所述标记可以产生非特异性，因为在成人细胞中存在产生胎儿血红蛋白的情况，或归因于胎儿血红蛋白和成人血红蛋白的抗体之间的交联，这是由这些血红蛋白链的类似性所引起的。MonaLiza医疗公司(美国专利2005/0181429A1)开发了使用经宫颈细胞的产前遗传分析方法。所述方法基于Pap涂片细胞刷用于回收经宫颈样品的用途，所述样品通过细胞离心处理以用于制备载玻片。标记经宫颈细胞并且在显微镜下进行分析并且记录它们在载玻片上的位置和坐标。在FISH中分析载玻片并且使用先前获得的坐标鉴定营养细胞。所述方法的缺点是，在用于制备载玻片的处理期间，损失部分经宫颈细胞，其由于营养细胞的缺乏而无响应(no-call)。AVIVA-Biosciences公司(见，例如EP-A-1439897)开发了基于生物芯片的富集系统，以用于从母体血液分离胎儿细胞。该方法使用容许除去大部分红细胞的试剂，借助于高度特异性的磁珠和胎儿抗原的特异性抗体的混合物(cocktail)的分类，和借助于具有根据待分离细胞类型的可变直径孔的高分辨率过滤室的富集。然而，所述方法被局限于通过样品富集选择胎儿细胞，这不限制具有污染的母体细胞的可能性，和因此后续发生不可靠遗传分析的风险。简言之，迄今没有一种以上提到的非侵入性方法证明其可以被用作诊断胎儿非整倍性和/或其它染色体缺陷的常规实践。因此本专利技术的目的是提供用于非侵入性产前诊断的方法，其基于采样高概率含有循环胎儿具核细胞的有机母体流体和它们的后续分离物，具体地，子宫、宫颈内或经宫颈流体、或外周母体血。本专利技术的另一个目的是提供用于产前诊断的方法，其可以是自动的，没有假阴性，并且具有低数量的假阳性和无响应。专利技术概述本专利技术涉及用于非侵入性产前诊断，特别是用于确定胎儿中的遗传异常的方法和>J-U ρ α装直。因此，根据本专利技术，该诊断基于高概率含有胎儿具核细胞的有机母体流体及其后继分离物，具体地，来自子宫，宫颈内或经宫颈的流体或外周母体血而进行，识别和分析其中存在的胎儿细胞，其根据权利要求1的方法进行。根据本专利技术，首先通过胎儿具核细胞的一个或多个富集阶段处理子宫、宫颈内或经宫颈的流体或外周母体血。所述方法的特征在于，使用能以容易可自动化和可重复的方式，由富集样品单独选择单个细胞的微型流体系统。通过分离单个细胞的微型流体系统，有可能获得一组具有足以进行遗传诊断的纯度的胎儿细胞。通过微型流体装置，本专利技术人意指适于使用层流控制液体体积的装置。通过微型流体装置，本专利技术人进一步意指具有至少一个小于1_的维度的装置。通过能单独选择单个细胞的装置，本专利技术人意指能基于对每个细胞单独评价的参数，每次一个或同时地进行一个或多个单个细胞选择的装置。然后可以通过下列技术，诸如定量荧光PCR(QF-PCR)进行遗传分析，如果必要，使用母体细胞的分析用于比较，FISH，核型或比较基因组杂交(CGH)。微型流体系统的使用提供多种优点，包括具有一次性(disposable)系统的可能性，在不同的分析之间没有污染风险，或不需要彻底清洗设备。而且，微型流体系统的使用提供具有自动或半自动系 统的可能性，其特征在于高可靠性水平。从一些非限制性实施例的下列描述，参考附图的图，本专利技术另外的特征和优点将呈现清楚。附图简述图1显示根据本专利技术的非侵入性产前诊断方法的概图。图2显示具有IOX放大倍数的芯片图像，其使用DAPI的荧光滤波器。可以观察到三个细胞核，对应三个单个细胞。图3显示具有IOX放大倍数的芯片图像，其使用FITC的荧光滤波器。拍照区域与图2相同，并且可以观察到两个Hb- ε阳性细胞和一个Hb- ε阴性细胞。图4显示关于染色体标记物AMXY、D21S11和HPRT分析的电泳图谱。上图指关于从母体血液回收的胎儿细胞进行的分析，下图指关于母体细胞进行的分析。该图显示胎儿中存在性染色体X和Y ，并且在D21S11处，胎儿细胞具有从母亲(M)继承的第一等位基因和不同的第二等位基因(属于父系来源(P))。图5显示关于染色体标记物D18S391、D13S631和D21S1411分析的电泳图谱。上图指关于从母体血液回收的胎儿细胞进行的分析，下图指关于母体细胞进行的分析。该图显示关于标记物D13S631和D21S1411，存在两种等位基因(正常杂合子)，且母体细胞的污染可以被排除。图6显示关于标记物D21S1437和D21S1446分析的电泳图谱。上图指关于从母体血液回收的胎儿细胞进行的分析，下图指关于母体细胞进行的分析。该图显示存在两种等位基因(正常杂合子)，并且母体细胞的污染可以被排除。图7显示关于标记物D18S535分析的电泳图谱。上图指关于从母体血液回收的胎儿细胞进行的分析，下图指关于本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于非侵入性产前诊断的方法，所述方法包括下列步骤：ａ．由怀孕女性获得有机流体样品，所述有机流体高概率地含有胎儿具核细胞；ｂ．使所述有机流体样品富含至少一个包括至少一种类型的胎儿具核细胞的细胞群；ｃ．从所述至少一种类型的胎儿具核细胞中分离至少一个细胞；ｄ．对从所述至少一种类型的胎儿具核细胞中分离的所述至少一个细胞进行遗传分析，以便突出所述至少一个胎儿具核细胞的至少一种遗传特征，适于容许所述诊断；其特征在于，所述从所述至少一种类型的胎儿具核细胞中分离至少一个细胞的步骤是通过在设计用于所述目的的微型流体装置中单独选择单个细胞而进行的。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：尼科洛马纳雷西，安东尼奥菲蒂帕尔迪，朱塞皮焦尔吉尼，詹内伊梅多罗，
申请(专利权)人：硅生物系统股份公司，
类型：发明
国别省市：IT[意大利]