二元episomal CRISPR/Cas12i系统及其构建方法和应用技术方案

本发明专利技术公开了二元episomal CRISPR/Cas12i系统及其构建方法和应用，属于基因编辑工具技术领域。本发明专利技术提供的episomal CRISPR/Cas12i系统，可提高无筛选标记的大片段基因整合效率，降低脱靶效应；可介导大片段DNA整合至基因组，且携带筛选基因的游离载体可以在细胞内长时间稳定表达，时间不少于15天，在转染后第10天的相对表达量最高；可以实现基因序列的定点替换，且对转染细胞的毒性低，安全性更高，可大幅延长转染细胞在添加筛选药物培养基中的存活时间，以满足相对长时间的实验要求。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因编辑工具，尤其是涉及二元episomal crispr/cas12i系统及其构建方法和应用。

技术介绍

1、传统的crispr/cas系统是一种精准的基因编辑技术，可以通过切割基因组dna产生双链断裂(double-strandbreak，dsb)，再通过同源重组(homologous recombination，hdr)修复实现基因的插入和序列替换，但由于hdr发生频率较低，所以基于hdr的基因整合效率较低。

2、基于epstein-barr病毒(epstein-barrvirus，ebv)的两个元件，即潜伏病毒dna复制子(orip)和潜伏病毒蛋白epstein-barr核抗原1(ebna1)而衍生的载体，可以游离在细胞内，在每个细胞周期进行一次复制，并分离到子细胞中，而不与细胞基因组整合。基于orip和ebna1的游离载体已被证明是重编程研究中获得无载体细胞的有效方法，ebv衍生载体已被广泛用于哺乳动物细胞的基因治疗和基因表达。

3、目前关于episomal crispr/cas系统的研究，主要聚焦于基因的敲本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.二元episomal CRISPR/Cas12i系统，其特征在于：包括二元episomal CRISPR/Cas12i系统I和二元episomal CRISPR/Cas12i系统II。

2.根据权利要求1所述的二元episomal CRISPR/Cas12i系统，其特征在于，二元episomal CRISPR/Cas12i系统I包括如下核心组件：

3.根据权利要求2所述的二元episomal CRISPR/Cas12i系统，其特征在于：所述(1)中其中CAG启动子驱动的化脓性链球菌Cas12i核酸酶基因与U6启动子调控的靶向特异性单链引导RNA，通过T2A自切...

【技术特征摘要】

1.二元episomal crispr/cas12i系统，其特征在于：包括二元episomal crispr/cas12i系统i和二元episomal crispr/cas12i系统ii。

2.根据权利要求1所述的二元episomal crispr/cas12i系统，其特征在于，二元episomal crispr/cas12i系统i包括如下核心组件：

3.根据权利要求2所述的二元episomal crispr/cas12i系统，其特征在于：所述(1)中其中cag启动子驱动的化脓性链球菌cas12i核酸酶基因与u6启动子调控的靶向特异性单链引导rna，通过t2a自切割肽串联cas12i核酸酶基因与筛选标记基因；(2)中同源臂为800-900bp。

4.根据权利要求1所述的二元episomal crispr/cas12i系统，其特征在于，二元episomal crispr/cas12i系统ii包括如下...

【专利技术属性】
技术研发人员：高元鹏，祝振亮，张勇，见杨祎，王心语，张涌，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：