一种构建细菌突变体文库的方法及其应用技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，本发明专利技术提出构建细菌突变体文库的方法及其应用，方法包括:（1）基于目的蛋白的突变位点，对其编码核酸进行拆分处理，构建编码目的蛋白的饱和突变位点片段;（2）构建包含表达信号标记、SUMO‑FutC酶片段，且不含IIS型限制酶酶切位点的第一载体;（3）将饱和突变位点片段与第一载体进行连接，以获得饱和突变载体库;（4）将饱和突变载体库中的载体转入细菌中，以获得细菌突变体文库。所述细菌突变体文库可结合微流控技术，筛选目的蛋白的关键功能位点和对应菌株，例如，可高效获得高产2'‑岩藻糖基乳糖的目标菌株，其产量为野生型菌株的4.7倍~7.6倍，同时节省时间、仪器、试剂成本，操作要求低。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物，具体的，本专利技术涉及一种构建细菌突变体文库的方法及其应用。

技术介绍

1、随着生物技术的飞速发展，酶和细胞工厂在食品、化工、环境和能源等众多行业的应用日益增多，为工业与能源的可持续发展注入了新动力。然而，自然状态下的酶和细胞性能往往不能满足复杂的工业需求，因此需通过定向改造来提升其活性、立体选择性、稳定性、底物特异性以及提高细胞工厂的生产效率。定向改造是一种模拟自然进化的实验室技术，针对特定的酶蛋白，通过错配pcr、人工合成等方式构建特定碱基位点突变的dna库，以表达特定位点氨基酸改变的蛋白，并设计实验筛选阳性菌株。目前，多种构建突变库的方法已被开发并广泛应用，但灵敏且可靠的超高通量筛选方法仍然是实现酶和细胞工厂高效进化的主要瓶颈。目前突变体文库的传统筛选方法：琼脂平板和微孔板筛选法，是目前应用最广泛的两种筛选技术。

2、琼脂平板法是一种常规且广泛应用的突变体文库筛选方法，操作简单并适合于大规模的初筛。琼脂平板法可分为表型活性筛选和表型生长选择。表型活性筛选利用菌落周围产生的水解圈、颜色圈或荧光产物等进行酶活或目标产物的筛本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种构建细菌突变体文库的方法，其特征在于，所述方法包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述岩藻糖基转移酶具有SEQ ID NO:1或2所示的氨基酸序列；和/或

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述突变位点为SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的第150位和第188位中的至少之一，和/或，所述突变位点为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的第176位、第177位、第215位、第218位、第274位、第275位和第276位中的至少之一；和/或

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述信号标记包括荧光标记、抗性标记中的至...

【技术特征摘要】

1.一种构建细菌突变体文库的方法，其特征在于，所述方法包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述岩藻糖基转移酶具有seq id no:1或2所示的氨基酸序列；和/或

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述突变位点为seq id no:1所示的氨基酸序列的第150位和第188位中的至少之一，和/或，所述突变位点为seq id no:2所示的氨基酸序列的第176位、第177位、第215位、第218位、第274位、第275位和第276位中的至少之一；和/或

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述信号标记包括荧光标记、抗性标记中的至少之一；和/或

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述信号标记包括绿色荧光蛋白；和/或

6.一种细菌突变体文库，其特征在于，所述细菌突变体文库是由权利要求1~5任一项所述的构建细菌突变体文库的方法获得的。

7.一种高通量筛选高产2'-岩藻糖基乳糖菌株的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙浩源，任俊霞，陈海新，谢雪峰，方晓东，
申请(专利权)人：三亚华大生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：