已溶血的全血样品中待分析物的检测制造技术

本发明专利技术涉及在已溶血的全血样品中检测待分析物的方法，所述方法包括将已知或者疑似含有令人感兴趣的待分析物的已溶血的全血样品施加于到含有限进色谱材料（ＲＡＭ）的柱子，从而结合所述待分析物，将所述待分析物从所述ＲＡＭ上洗脱并检测所述待分析物，其中，至少在第一步中使用ｐＨ高于８．０的缓冲液。优选为所述已溶血的全血样品获得自差分溶血。所述新方法确保了，尤其是在后续分析中，血红蛋白不干扰令人感兴趣的待分析物的检测。所述方法可容易地应用于例如来自已溶血的全血样品的许多待分析物的在线检测中，例如应用于抗生素、叶酸或诸如他克莫司或西罗莫司等免疫抑制药物的检测。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】已溶血的全血样品中待分析物的检测本专利技术涉及在已溶血的全血样品中待分析物的检测方法，所述方法包括将已知或者疑似含有令人感兴趣的待分析物的已溶血的全血样品施加于到含有限进色谱材料(restrictedaccesschromatographymaterial(RAM))的柱子，从而结合所述待分析物，将所述待分析物从所述RAM上洗脱并检测所述待分析物，其中，至少在第一步中使用pH高于8.0的缓冲液。所述新方法确保了血红蛋白不干扰令人感兴趣的待分析物的检测。所述方法可容易地应用于例如来自已溶血的全血样品的许多待分析物的在线检测中，例如应用于抗生素、叶酸或诸如他克莫司(tacrolimus)或西罗莫司(sirolimus)等免疫抑制药物的检测。
技术介绍
样品中成份越多，其中所包含的目标待分析物的分析越困难。红血细胞含有非常大量的蛋白质和小分子量成份，它们对诸如全血等生物流体中令人感兴趣的待分析物的检测可能具有潜在的干扰。这是为什么在临床常规中分别使用血液血浆或简称为血浆(即抗凝全血样品；除去细胞和红细胞)或血液血清或简称为血清(即凝结全血；除去细胞、红细胞凝结体系中的大部分蛋白尤其是纤维蛋白/纤维蛋白原)的主要原因之一。例如与血清或血浆相比，全血样品液更难以处理。全血趋于更不稳定，并且红细胞的缓慢破裂将破坏相当数量的令人感兴趣的待分析物的可靠测量。如上所述，可以由全血获得血清或血浆并用于待分析物的检测。理论上可以通过过滤或离心从全血中除去细胞和红细胞。然而，这些方法要么不适用于常规诊断环境设置，要么它们不能进行至少部分存在于红血细胞中的那些待分析物的正确测量。在本领域中广泛已知的用于全血样品中待分析物的检测的绝大多数方法都要求在待分析物能够被量化之前对样品进一步的处理。在许多方法中，首先通过选择性沉淀或萃取方法从潜在干扰性物质中分离令人感兴趣的待分析物。萃取可在液相中或固相上进行。通过分别描述在一些免疫抑制药物或叶酸的检测中使用的方法能对此进行举例说明。广泛已知的免疫抑制药物例如有霉酚酸酯(mycophenolatemofetil)(MMF)、纳巴霉素(rapamycin)(RAPA，也称为西罗莫司(sirolimus))和他克莫司(tacrolimus)(FK-506)。免疫抑制药物的治疗性药物监测对于器官移植患者以及患有AIDS的患者尤其重要(参见，例如：Drug.Ther.Perspect.17(22)(2001)8-12)。大多数进行实体器官移植的患者需要终身免疫抑制治疗以防止同种异体移植排斥。但是，因为许多免疫抑制剂具有很窄的治疗范围并且与各种毒性和潜在药物相互作用相关，因此治疗性药物监测(TDM)和患者临床评估的联合使用将是尤其重要的。他克莫司是首先于1994年获得美国食品和药物管理局(USFoodandDrugAdministration(FDA))批准的用于防止肝同种异体移植排斥的大环内酯类抗生素。于体外其效力比环孢霉素高多至100倍，并且临床上，其与组织排斥发生率的更显著降低有关。已证实他克莫司作为经受了各种移植过程的患者中的首要免疫抑制疗法，以及作为在进行肝或肾移植后出现高排急性同种异体移植排斥(refractoryacuteallograftrejection)的患者中的抢救疗法的疗效。治疗谷浓度(therapeutictroughconcentration)为5-20μg/L。由于存在于循环中的至少部分他克莫司被隔离在红细胞中，因此在该药物的临床常规测量中使用全血样品。例如可以通过高效液相色谱(HPLC)、与质谱(MS)联用的HPLC、放射受体分析(RRA)或者通过免疫分析(IA)等检测他克莫司。后两种方法并不能利用相同的灵敏度检测他克莫司及其某些代谢物。这将导致在所采用的方法中出现干扰(Murthy，J.N.等人，Clin.Biochem.31(1998)613-617)。至少在他克莫司的各种代谢物的检测中，HPLC-MS-法可被作为黄金标准。然而，以上提到的所有方法均要求从全血中萃取他克莫司。通常，在临床常规中使用乙腈从全血中萃取他克莫司，并且似乎不存在方法能够进行全血样品中他克莫司的在线测量。与他克莫司相似，西罗莫司也是大环内酯抗生素。其首先于1999年获得USFDA的批准用于防止肾移植后的同种异体移植排斥，并且实际上，在与环孢霉素和皮质类固醇联合急性使用时也显示出在该方面的令人鼓舞的结果。于体外，西罗莫司的功效比环孢霉素强多至100倍，并且临床上，其表现出与环孢霉素的协同作用，也许能减少环孢霉素的剂量。治疗谷浓度为5-15μg/L。与他克莫司类似，显著量的西罗莫司存在于红细胞中。因此，不管使用任何检测方法，均要求全血样品的萃取。在临床常规中，被怀疑含有西罗莫司的样品经HPLC并通过紫外光(UV)或串联质谱(MS/MS)进行检测。最近，还报道描述了一种微粒酶免疫分析法(Jones，K.等人，ClinicalTherapeutics22，Suppl.B(2000)B49-B61)。叶酸是一组氧化态各不相同的相关分子的统称。叶酸是水溶性维生素B家族的一部分，其作为高半胱氨酸代谢的辅酶以及在DNA复制所需的单碳基团转移中起到重要作用。叶酸不足的状态与增高的神经管缺陷风险相关，与心血管疾病、贫血相关，与各种癌肿以及与阿尔茨海默病相关。血清或血浆叶酸浓度反映了最近的饮食摄入，因此红细胞叶酸浓度更能指示身体储存(Gunter，E.W.等人，Clin.Chem.42(1996)1689-1694；Fazili，Z.等人，Clin.Chem.51(2005)2318-2325；Pfeiffer，C.M.等人，Clin.Chem.50(2004)423-432)。红细胞总叶酸(红血细胞叶酸＝RBC-叶酸)是全身叶酸状态的最好衡量值。最近的研究表明5-甲基四氢叶酸是循环血细胞中的主要叶酸类维生素。为了诊断叶酸不足，由于超过95％的叶酸位于血细胞中，因此推荐不仅由血清或血浆进行测量，而且也由血细胞进行测量。血细胞中的浓度能更真实地反映实际叶酸状态。已有诸多方法可供使用以测量在不同基质中的叶酸。主要分析方法是微生物分析、放射免疫分析、化学发光、色谱法以及质谱法。大多数方法基于叶酸与叶酸结合蛋白的竞争性结合。对于RBC-叶酸的测量，溶血剂的使用显然是必须的。例如，用于RBC叶酸测量的ElecsysTM分析(Elecsys是RocheGroup成员的注册商标)使用抗坏血酸作为溶解剂。ElecsysRBC-叶酸溶血剂与用于定量测定血细胞中叶酸(RBC-叶酸)的Elecsys叶酸分析一起使用。经抗凝剂(肝磷脂或EDTA)处理的全血用抗坏血酸溶液(0.2％)稀释并于20-25℃温育大约90分钟。发生血细胞的溶解并伴随细胞内叶酸的释放。然后将溶血产物用作“预稀释”样品(与血清类似)以备用于随后Elecsys叶酸分析中的测量。在血细胞叶酸浓度的计算中对全血中测定的血细胞比容值与样品经预处理带来的稀释效应进行补偿(Greiling，H.，Gressner，A.M.，LehrbuchderKlinischenChemieundPathobiochemie，3rded.，Stuttgart-NewYork，Sch本文档来自技高网...

【技术保护点】
已溶血的全血样品中待分析物的检测方法，所述方法包括：　ａ）将已知或者疑似含有令人感兴趣的待分析物的已溶血的全血样品施加于到含有限进色谱材料（ＲＡＭ）的柱子，从而结合所述待分析物，　ｂ）从所述ＲＡＭ上洗脱所述待分析物，和　ｃ ）检测所述待分析物，　其中至少在步骤（ａ）使用ｐＨ高于８．０的缓冲液。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】EP 2007-6-6 07011169.51.已溶血的全血样品中待分析物的检测方法，所述方法包括：a)将已知或者疑似含有令人感兴趣的待分析物的已溶血的全血样品施加于到含有限进色谱材料(RAM)的柱子，从而结合所述待分析物，b)从所述RAM上洗脱所述待分析物，和c)检测所述待分析物，其中至少在步骤(a)使用pH为9.5-12.5的缓冲液，以及所述待分析物具有10kDa或更小的分子量，其中，所述缓冲液的浓度为5mM-20mM,其中，所述待分析物选自免疫抑制药物、滥用药物、叶酸和叶酸类维生素，其中，所述免疫抑制药物选自环孢霉素CsA、霉酚酸酯MMF、瑞帕霉素RAPA、他克莫司FK-506、硫唑嘌呤AZA和甲基泼尼松龙MP，其中所述滥用药物选自安非他命、可卡因和可卡因代谢物、甲基安非他命、阿片剂和...

【专利技术属性】
技术研发人员：U科博尔德，N德尔莫特，C休伯，H冯德埃尔茨，
申请(专利权)人：霍夫曼拉罗奇有限公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]