ＶＥＧＦ－Ｄ突变体及其用途制造技术

本发明专利技术是一种ＶＥＧＦ－Ｄ蛋白，其包含在二聚体界面上的一个或多个氨基酸突变；以及其在治疗中尤其是在促进血管发生中的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及对VEGF-D的修饰，所述修饰增加其对VEGF受体的活性；及其在治疗中 的用途。
技术介绍
血管内皮生长因子(VEGF)不仅被认为是在成年期维持脉管系统的关键生长因 子，还被认为是在胚胎发生过程中诱导血管发生和淋巴管发生的关键生长因子。还在若干 病理状态如癌症和视网膜病中发现了它们的不正常表达。VEGF-A属于较大的相关生长因子 家族，所述家族包括VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和胎盘生长因子PIGF，以及来源于口疮病毒的 VEGF-E蛋白和蛇毒中的多种同源物。人类内源性VEGF蛋白家族成员以若干异构体形式存 在，这是mRNA的可变剪接的结果或是由于蛋白水解处理所致。这些变体的血管发生作用区 别很大，因为它们对三种主要的VEGF受体、共受体例如神经菌毛素(neuopilin)、硫酸类肝 素蛋白多糖以及细胞外基质的其他组分的特异性和亲和性不同。 VEGFR-2是最重要的调控血管发生的受体，其主要在内皮细胞中表达。哺乳动物 VEGFR-2配体包括VEGF-A、VEGF-C和VEGF-D。除VEGFR-2以夕卜，VEGF-C和VEGF-D也是介导 淋巴管发生并因此参与到淋巴脉管系统形成的受体VEGFR-3的配体，。VEGF-A还与在胚胎 发生过程中主要作为非信号传递的诱骗受体VEGFR-1结合。已知这种受体在成年有机体中 调节炎性细胞例如巨噬细胞和单核细胞的迁移，但其在血管发生中的作用仍然存在争议。 由于VEGF家族成为血管发生调节因子的重要性，它们已被建议作为可能的治疗 剂以调节不同病理状态的血管发生过程(Y投-Herttuala2003)。通过将VEGF直接作为重 组蛋白或使用基因治疗载体而引入组织以诱导血管发生，从而进行了体内研究(Markkanen 2005)。若干研究的发现表明，VEGF家族成员在体内具有强血管发生活性，并且它们可 用于治疗疾病如下肢缺血和冠状动脉疾病。除了这些因素以外，还已发现成熟形式的 VEGF-D (VEGF-DANAG，见下)和VEGF-A最有希望诱导治疗性血管发生。 VEGF与血小板衍生生长因子(PDGF)结构相似并同属于VEGF/PDGF家族，后者属于 更大的半胱氨酸结生长因子超家族。家族成员分都具有在许多细胞外蛋白中发现的并在许 多物种中保守的半胱氨酸结基序。半胱氨酸结蛋白的性质是它们包含一个通过3个二硫键 连接的反平行P折叠的保守结构。半胱氨酸结生长因子通常形成二聚体，其在VEGF/PDGF 家族中经常通过亚基间二硫键连接。 VEGF受体属于被二聚化激活的受体蛋白酪氨酸激酶。配体的二聚化对VEGFR的 激活是必需的。 一个VEGF-A二聚体从其两端分别与两个受体单体结合，从而诱导受体二聚 化，继而诱导细胞内酪氨酸激酶活性。基于若干种通过实验得到的游离或与VEGF受体形成 复合体的VEGF家族成员的3D结构，它们具有极其相似的三级结构并因此很可能通过相似 的机制诱导受体激活。 在所述VEGF家族中，VEGF-C和VEGF-D可再被细分为其各自的子家族，这表现在 其与其它VEGF相比时具有更高的一级序列结构相似性。存在若干特征性性质，包括l)它们是结合VEGFR-3-淋巴管发生介导受体的唯一 VEGF ;2)与VEGF-A、 VEGF-B和PLGF相比，VEGF-C和VEGF-D以长前体蛋白的形式表达。这些形式的受体结合亲和性很弱，并且， 为转变为更有活性的生长因子，VEGF-C和VEGF-D的N末端和C末端都历经蛋白水解处理； 3)与所述家族的其他成员相比，历经蛋白水解处理的VEGF-D的成熟形式VEGF-DANAG已被 发现主要以非共价结合的二聚体或单体的形式存在，只有一小部分是以共价结合的二硫键 连接的二聚体的形式存在。这些研究还显示VEGF-DAWAG的单体与其二聚体相比也只有非常 微弱的活性。所述二聚体主要为非共价的性质有点令人惊讶，因为在其他VEGF家族生长因 子中形成所述亚基间连接的半胱氨酸残基在VEGF-D蛋白中是保守的。 以前的研究已经诱变过半胱氨酸结结构中包含的VEGF-A的半胱氨酸，以研究它 们对所述蛋白结构和功能的重要性。研究发现亚基间二硫键对VEGF-A的生物学功能是必 需的，因为在这些半胱氨酸被突变为丙氨酸时的VEGF-A丧失了其生物学活性。在其中保守 的半胱氨酸之一 (Cysl56)转变为丝氨酸时，VEGF-C突变体完全丧失了其对VEGFR-2的激 活能力，但仍能够激活VEGFR-3。 VEGF-C和VEGF-D两者的成熟形式也都包含一个不成对的 半胱氨酸残基，其位置接近于预想的形成亚基间二硫键的半胱氨酸残基。最近研究表明线 虫(C. elegans)的pvf-1基因编码一种可激活人类VEGFR-1和VEGFR-2且也是仅部分共价 结合的二聚体的VEGF/PDGF同源物。这种蛋白也像VEGF-C和VEGF-D —样，在其二聚体界 面上具有一个不成对的半胱氨酸。
技术实现思路
本专利技术基于以下研究将在其他VEGF中负责形成亚基间二硫键的半胱氨酸 和VEGF-D中不成对的半胱氨酸残基每一个均分别诱变为丙氨酸，作为成熟VEGF-D形式 VEGF-DANAC的蛋白支架(Achen 1998， Stacker1999)。对VEGF-D进行蛋白水解处理从而使 其更具有活性，但这种蛋白水解处理形式主要以非共价结合的二聚体或单体的形式存在。 已经发现，通过诱变改变VEGF-D的二聚体形成界面可增加成熟VEGF-D即VEGF_DANAG的共 价二聚化。还发现，用多种不同氨基酸替换VEGF-DANAe蛋白的Cys25增加了共价二聚体的 形成，并且还显著增加了所述蛋白对VEGF受体的活性。本专利技术基于以下发现VEGF配体的 共价二聚化更有利于VEGF受体的激活。因此本专利技术是一种VEGF-D蛋白，所述蛋白通过一 个或多个氨基酸被其他氨基酸所替换而得以修饰，从而改变了其二聚体界面。附图说明 图1示出了 VEGF-DAWAG氨基酸序列与哺乳动物VEGF家族成员的VEGF同源结构域 序列的比对。VEGF-DAw序列中的半胱氨酸残基和突变的半胱氨酸残基以高亮标出。 图2示出了VEGF-DAWAG的同源模型上突变半胱氨酸残基的位置。所述突变的半胱 氨酸氨基酸残基根据它们在VEGF-DANAe序列上的位置被命名。具体实施例方式因此本专利技术是一种VEGF-D蛋白，所述蛋白通过一个或多个氨基酸被其他氨基酸 所替换而得以修饰，从而改变了其二聚体界面。这一限定包括任何影响VEGF-D蛋白的二聚 体界面的氨基酸突变，即所述氨基酸对VEGF-D 二聚体形成具有重要作用。所述二聚体界面是二聚化时VEGF-D蛋白上与另一个VEGF-D蛋白结合的区域。优选地，所述二聚体界面的构象被改变。这一现象的出现可能是由于所述突变影响了蛋白三维结构。突变的氨基酸可以是当所述蛋白二聚化时与另一个氨基酸结合的氨基酸。可改变所述二聚体界面的一个氨基酸实例是VEGF-DANAG的Cys25。 本专利技术的VEGF-D蛋白包含突变从而所述蛋白的二聚化性质与野生型蛋白相比发生了改变。优选地，本专利技术的VEGF-D突变体比野生型VEGF-D具有更高的二聚体对单体的比例。因此，在本专利技术中，所述本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ＶＥＧＦ－Ｄ蛋白，所述蛋白通过一个或多个氨基酸被其他氨基酸所替换而得以修饰，从而改变了其二聚体界面。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】GB 2007-5-31 0710457.3一种VEGF-D蛋白，所述蛋白通过一个或多个氨基酸被其他氨基酸所替换而得以修饰，从而改变了其二聚体界面。2. 根据权利要求1的蛋白，其中所述一个或多个氨基酸包括Cys。3. 根据权利要求1或2的蛋白，其是经修饰的VEGF-DANAG(SEQ IDN0:1)。4. 根据权利要求3的蛋白，其中VEGF-DANAG的Cys25残基被另一种氨基酸替换。5 根据前述权利要求任一项的蛋白，其中所述其他氨基酸为Leu、 Ile、 Val、Ala、 Ser、 Phe、 Trp或Asn。6. 根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：P图埃瓦恩，KJ埃润尼，S埃拉赫图阿拉，
申请(专利权)人：ARK治疗学有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[英国]