一种虾肝肠胞虫孢壁蛋白互作多肽的筛选与快检方法技术

本发明专利技术公开了一种虾肝肠胞虫孢壁蛋白互作多肽的筛选与快检方法，包括以下步骤：S1、Pmal‑EhSW12重组质粒的构建与提取；S2、重组蛋白的表达与纯化；S3、EhSW12蛋白互作多肽的筛选；S4、多肽亲和力鉴定；S5、对EHP孢壁蛋白EhSW12的快速检测。本发明专利技术具备对虾肝肠胞虫进行快速检测的优点，解决了目前的虾肝肠胞虫检测方法在使用的过程中，表普遍存在操作复杂、依赖精密仪器和检测周期长的问题，难以满足基层养殖场对现场快速检测的需求的问题。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及水产养殖，具体为一种虾肝肠胞虫孢壁蛋白互作多肽的筛选与快检方法。

技术介绍

1、南美白对虾作为全球水产养殖业中最重要的经济虾类之一，因其生长速度快、适应性强和养殖成本低的优势，具有极高的经济价值。然而，近年来虾肝肠胞虫的流行已成为制约该产业发展的重要因素。虾肝肠胞虫是一种专性寄生在对虾肝胰腺上皮细胞中的微孢子虫病原体，主要引起肝胰腺组织病变，影响对虾的消化与营养吸收功能，导致其生长迟缓甚至减产，给虾类养殖业带来严重的经济损失。

2、虾肝肠胞虫主要通过感染性孢子经口摄入传播，也可通过受污染的水源、饲料、养殖环境以及带毒虾苗进行扩散，因此对其实施早期快速检测是控制疾病传播的关键。目前针对虾肝肠胞虫的检测方法主要包括环介导等温扩增、荧光定量和重组酶聚合酶扩增等分子生物学技术。这些方法虽然在灵敏度和特异性方面表现良好，但普遍存在操作复杂、依赖精密仪器、检测周期长等问题，难以满足基层养殖场对现场快速检测的需求。因此，亟需开发一种简便、快速、无需复杂设备即可使用的新型检测手段，以实现对虾肝肠胞虫的即时诊断和有效防控。>

<本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种虾肝肠胞虫孢壁蛋白互作多肽的筛选与快检方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种虾肝肠胞虫孢壁蛋白互作多肽的筛选与快检方法，其特征在于：所述S1中进行重组质粒的构建与提取时，首先根据目标基因EhSW12序列，使用BamH1扩增引物，用于后续PCR扩增过程中特异性地扩增出EhSW12基因片段，从含有目标基因的生物样本中提取总DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳分离所需大小的DNA片段，再用割胶纯化试剂盒进一步纯化这个片段，确保获得高质量的DNA样品用于接下来的操作，选择原核载体Pmal-c5X(+)，并使用BamH1限制性内切酶对其进行切割，准备接受目标基因...

【技术特征摘要】

1.一种虾肝肠胞虫孢壁蛋白互作多肽的筛选与快检方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种虾肝肠胞虫孢壁蛋白互作多肽的筛选与快检方法，其特征在于：所述s1中进行重组质粒的构建与提取时，首先根据目标基因ehsw12序列，使用bamh1扩增引物，用于后续pcr扩增过程中特异性地扩增出ehsw12基因片段，从含有目标基因的生物样本中提取总dna，并通过琼脂糖凝胶电泳分离所需大小的dna片段，再用割胶纯化试剂盒进一步纯化这个片段，确保获得高质量的dna样品用于接下来的操作，选择原核载体pmal-c5x(+)，并使用bamh1限制性内切酶对其进行切割，准备接受目标基因片段，使得目标基因可以被插入，使用无缝克隆试剂盒将经过纯化的ehsw12基因片段和已经酶切的载体进行连接反应，生成重组质粒，将重组质粒导入感受态细菌细胞transt1中，并在含有氨苄青霉素的lb平板上培养，筛选出成功接受了重组质粒的细菌菌落，挑取单个菌落进行pcr验证，确认是否成功插入了目标基因，最后，从筛选出的阳性克隆中提取重组质粒，并对其进行测序分析，确保插入的目标基因序列准确无误。

3.根据权利要求2所述的一种虾肝肠胞虫孢壁蛋白互作多肽的筛选与快检方法，其特征在于：所述s2中进行重组蛋白的表达与纯化时，将构建好的含有目标基因ehsw12的重组质粒转化到bl21(de3)大肠杆菌中，来高效地表达外源蛋白，从lb平板上挑取一个过夜培养的阳性单菌落，接种到新鲜的液体培养基中进行扩大培养，当细菌生长到适当的密度后，加入异丙基β-d-硫代半乳糖苷以诱导目的蛋白的表达，通过离心收集细菌细胞，然后使用超声波处理使细菌裂解，释放出内部的蛋白质，再次高速低温离心后，得到包含可溶性蛋白的上清液和不溶性蛋白的沉淀，这两部分分别进行sds-page分析，以确定重组蛋白的主要存在形式，对于主要存在于上清中的重组蛋白，采用亲和层析的方法加入淀粉树脂进行纯化，使用bradford试剂盒对纯化的重组蛋白进行定量，同时，按照同样的表达和纯化步骤处理不含插入片段的空载体，以制备仅带有mbp标签的蛋白质，为后续的反向筛选实验提供对照样本，最后把所有获得的蛋白质样品都保存在-80℃条件下，以保持其活性和稳定性。

4.根据权利要求3所述的一种虾肝肠胞虫孢壁蛋白互作多肽的筛选与快检方法，其特征在于：所述s3中进行ehsw12蛋白互作多肽的筛选时，以重组蛋白mbp-ehsw12作为底物，使用ph.d.tmphage display peptide library kits v2中的噬菌体展示肽库进行筛选，首先将mbp-ehsw12固定在固相支持物上，然后加入噬菌体展示肽库，使其中的多肽与底物接触并结合，使用tbst缓冲液洗去未能与mbp-ehsw12结合的噬菌体，仅保留那些成功结合的噬菌体-多肽复合物，通过蛋白竞争法洗脱已结合的噬菌体，即使用过量的游离mbp-ehsw12或其他相关物质来竞争性地取代结合在底物上的噬菌体，从而释放出结合力较强的噬菌体，将洗脱下来的噬菌体加入到新鲜的大肠杆菌培养液中进行感染和扩增，随后，通过低温高速离心收集细菌培养液的上清，并使用peg/nacl溶液浓缩噬菌体，得到第一轮筛选后的噬菌体集合，将上一轮筛选获得的噬菌体集合作为下一轮筛选的起始文库，重复上述步骤共四轮，每轮都富集与mbp-ehsw12结合更强的噬菌体，由于mbp标签本身较大，为了排除因mbp标签而非ehsw12蛋白本身导致的非特异性结合，在第三轮筛选时引入反向筛选步骤，反向筛选时使用表达的仅有mbp标签的蛋白作为底物，用第二轮结束的洗脱物与其结合，洗脱未结合的噬菌体，并将其用于后续筛选，以减少非特异性结合的影响，在最后一轮筛选后，从双层平板上随机挑选20个噬菌斑，送至生物公司进行dna测序，以确定其编码的多肽序列，通过比较不同轮次间噬菌体滴度的变化，评估筛选效果，并通过序列分析确认哪些多肽是真正与mbp-ehsw12特异性结合的。

5.根据权利要求4所述的一种虾肝肠胞虫孢壁蛋白互作多肽的筛选与快检方法，其特征在于：所述s4中进行多肽亲和力鉴定时，将筛选出的三条多肽、重组蛋白mbp-ehsw12、仅有mbp标签的蛋白质以及pbs作为阴性对照分别滴加到pvdf膜上，在pvdf膜上的每个点都加入不同的结合识别物，包括重组蛋白mbp-ehsw12、仅有mbp标签的蛋白质以及pbs对照，首先，加入针对mbp标签的单克隆抗体作为一抗，然后，加入hrp标记的羊抗鼠抗体作为二抗，这种抗体能够识别并结合一抗，从而间接地标记出结合了mbp-ehsw12或仅含mbp标签的蛋白质的位置，最后，通过化学发光法等方法使hrp催化底物反应产生可见的颜色变化，从而直观地显示哪些点发生了特异性的结合，帮助确认哪些多肽与ehsw12有特异性互作，进一步比较三条多肽对mbp-ehsw12的亲和力大小，将每条多肽按不同比例稀释后重复上述dotblot实验，通过比较不同浓度下的信号强度，判断哪个多肽即使在低浓度下也能有效结合mbp-ehsw12，从而确定它们的相对亲和力，根据dot blot的结果，选择显示出更强结合能力的多肽进行后续处理。

6.根据权利要求5所述的一种虾肝肠胞虫孢壁蛋白互作多肽的筛选与快检方法，其特征在于：所述s5中对ehp孢壁蛋白ehsw12进行快速检测时，使用percoll密度梯度离心法从对虾肝胰腺组织中分离出ehp，采用酶解法或者机械化学法处理分离得到的ehp，以释放孢壁蛋白ehsw12，使用胶体金溶液标记生物素化多肽3，在试纸条的检测线上喷涂筛选出的特异性多肽2，在试纸条的质控线上喷涂链霉亲和素，将上述组件整合到一起，形成一个完整的快速检测试纸条，以酶解出的eh...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢佳容，吕利群，谢小仰，
申请(专利权)人：运城渔博生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：