包含高浓度的生物活性分子的组合物及其制备工艺制造技术

公开了用于从细菌细胞制备具有感兴趣的生物活性分子的高纯度样品的大规模工艺。该方法包括以下步骤：通过使所述大量细胞的细胞悬浮液与溶胞溶液接触制备溶胞产物溶液；用中和溶液中和所述溶胞产物溶液以制备包含被中和的溶胞产物溶液和碎片的分散体；通过至少一个过滤器过滤所述分散体；对所述被中和的溶胞产物溶液进行离子交换分离以产生离子交换洗出液；和对所述离子交换洗出液进行疏水作用分离以产生疏水作用溶液。此外，提供了包含通过公开的大规模工艺制备的大量质粒ＤＮＡ的组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及包含高浓度的诸如质粒的生物活性分子的大批组合物(bulkcomposition)以及制备这样的组合物的工艺。
技术介绍
在细胞中产生并从细胞分离的生物活性分子存在许多用途。通过引用在此并入的美国公布序列号20050014245公开了用于生物材料制备的设备和方法。生物活性分子包括蛋白和核酸分子。在活细胞中制备这样的分子提供了相对可选择的制备方法的许多优势，但当从细胞中提取生物活性分子时出现了分离和纯化问题。在细胞中存在多种组分，这阻碍实现感兴趣的生物活性分子的高产率，也表示可能的不希望的污染物进入最终产品。 由于非病毒性基因疗法和DNA疫苗领域的出现，质粒制备是感兴趣的领域。质粒是大的并且复杂的高分子，除非断裂，其保持超螺旋DNA结构。与其使用合成方法，在多种情况下，在生物系统中制备它们并随后从那些系统中分离并纯化它们是更具有成本效益的。质粒的生物制备通常采取使包含感兴趣的质粒的大肠杆菌(Escherichia coli) ( E.coli)发酵的方式。 细胞溶胞和随后的用于制备用于纯化的工艺流的处理步骤是在任何质粒工艺中最困难、复杂和重要的步骤。在该过程中，对于每次质粒制备的运行定义产率和质量。对最佳方法的探求已经成为获得商业能力可接受的工艺的障碍，所述最佳方法是连续的、可縮放的并且产生可以不管质粒尺寸以高浓度配制的高质量产品。 使用碱和洗涤剂溶解细菌以纯化质粒是常用的技术。令人遗憾地，该方法对于大规模制备(或放大生产)呈现出显著的挑战。首先，含有溶胞溶液的悬浮细胞的完全混合在小规模下通过简单地使包含该细胞的容器涡旋或颠倒而容易操控。然而，这在其中体积可以在几十升或几百升范围内的大规模下是不现实的。用于混合大体积液体的常用技术，例如叶轮混合，是有问题的，因为当某些细胞在最初的混合后开始溶解时，它们释放显著增加溶液粘度的基因组DNA。这种粘度上的增加显著妨碍了进一步混合。另一挑战在于，在加入碱性溶胞溶液后在高PH下过多的孵育可导致质粒的永久变性，使其不适于大部分随后的用途，特别是用于治疗目的的用途。此外，众所周知，在该步骤的混合应当是完全的但足够温和的(即，低剪切)以防止大量来自絮状沉淀的物质进入含质粒的溶液。大量的宿主基因组DNA和内毒素存在于絮状沉淀中并且如果它们与质粒混合，它们在随后的纯化期间可能难以从质粒中分离。因此，质粒的大规模制备以某种方式使大量细胞暴露于溶胞溶液、使其混合并中和溶胞产物以最优化质粒产率、最小化质粒降解和最大化除去其他细胞成分以便该物质可被进一步纯化而以相对大的体积制备高浓度、高质量、高纯度的最终产品。 存在多种纯化质粒的现有方法；然而，这些方法不适于大规模制备。实验室规模的纯化技术不能简单地放大用于涉及大规模质粒制备的体积。大规模制备需要产率和分子完整性的最优化而同时使污染物的去除和质粒浓度最大化。在制备大量高浓度的质粒DNA中，存在将质粒维持为超螺旋形式和开环松弛形式的问题。储存条件通常需要高盐，并且即使在盐存在下，随时间的分子降解仍然是个问题。许多现有的纯化方法依赖于使用潜在地危险的、毒性的、诱变的或污染的物质和/或昂贵的物质或设备，这又是对于大规模制备所不期望的。某些现有的纯化方法利用酶的使用以消化蛋白用于最终的消除，而这样的酶对于大规模生产是昂贵的并且可造成生物污染的危险。 存在对诸如质粒的感兴趣的生物活性分子的大规模制备方法的需求，其中最终产品可以具有成本效益的方式制备，所述具有成本效益的方式例如最少的设备和/或最少的工艺步骤、高产率、高浓度和最少降解并且不存在杂质、污染物和不希望的物质。存在对具有高浓度和最少降解及存在最少杂质、污染物和不希望的物质的大量质粒溶液的需求以及对这样的溶液的制备方法的需求。对大量质粒的需求大于对是低拷贝数质粒的那些质粒的需求，所述低拷贝数质粒需要非常大量的细胞以得到毫克(mg)范围和以上的质粒量。 专利技术概述 本专利技术的一方面包括用于从细菌细胞中制备至少一种感兴趣的生物活性分子的高纯度样品的大规模工艺。所述大规模工艺包括以下步骤 a)通过使所述大量细胞的细胞悬浮液与溶胞溶液接触制备溶胞产物溶液； b)用中和溶液中和所述溶胞产物溶液以制备包含被中和的溶胞产物溶液和碎片的分散体； c)通过至少一个过滤器过滤所述分散体； d)对所述被中和的溶胞产物溶液进行离子交换分离以产生离子交换洗出液；禾口 e)对所述离子交换洗出液进行疏水作用分离以产生疏水作用溶液。在该方面的某些实施方案中，大规模工艺还包括通过所述疏水作用溶液的超滤制备至少一种生物活性分子的溶液的步骤。 本专利技术进一步方面包括用于从细菌细胞制备至少一种感兴趣的生物活性分子的高纯度样品的大规模工艺，其包括以下步骤使细菌细胞以细胞分散体与溶胞溶液接触以形成溶胞产物溶液；通过用泡罩塔混合器将中和溶液混入所述溶胞产物溶液而中和所述溶胞产物溶液以形成被中和的混合物；通过初级过滤器和二级过滤器过滤所述被中和的混合物以形成滤过的溶液；使所述滤过的溶液通过离子交换柱以形成离子交换溶液；使所述离子交换溶液通过疏水作用柱或疏水作用膜以形成疏水作用溶液；和超滤所述疏水作用溶液以形成至少一种感兴趣的生物活性分子的高纯度样品；其中在从接触步骤到使滤过的溶液通过的步骤的大规模工艺中的一个步骤向随后的步骤的每次过渡基本上连续发生。 在本专利技术的另一方面中，提供了组合物，其包含通过本文描述和公开的方法制备的至少一种感兴趣的生物活性分子，其中至少一种感兴趣的生物活性分子是DNA质粒。在某些实施方案中，所述组合物包含在溶液中的至少一种约10mg或更多的量的DNA质粒，其中高纯度的所述质粒是以大于约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%存在的质粒。 附图简述 通过参考附图，本领域技术人员可更好地理解本专利技术的多个目的和优势，其中 附图说明图1显示用于以连续流工艺从细菌细胞中分离和纯化感兴趣的生物活性分子的一个实施方案的示意图。 图2显示包含来自以下实施例1的样品的电泳凝胶的图。第1泳道表示超螺旋质粒标准梯带(supercoiled plasmid ladder) (Invitrogen);第2泳道细胞溶胞产物；第3泳道Q阴离子交换后的产物；第4泳道用疏水作用纯化后的产物；和第5泳道UF后混合的最终产物。 图3显示包含来自实施例3的样品的电泳凝胶的图。第1泳道表示超螺旋质粒标准梯带(Invitrogen);第2泳道表示在使用48 y m褶裙式滤筒(pleated cartridge)的初级过滤之后的溶胞产物；第3泳道表示在使用1 y m褶裙式滤筒的二级过滤之后的滤液；第4泳道表示在使用COHC Pod过滤器的三级过滤之后的滤液；第5泳道表示在经过MustangQ阴离子交换步骤之后的洗出液产物级分#1 ;和第6泳道表示Q洗出液的第二级分。 优选实施方案的描述 提供了从细胞中纯化感兴趣的生物活性分子的方法以便从该细胞中以高水平的纯度与浓度纯化感兴趣的生物活性分子。优选地，所述感兴趣的生物活性分子是质粒或DNA质粒。所述细胞可以是包含感兴趣的生物活性分子的任何细胞。在某些实施方案中，所述细胞是微生物细胞，例如诸如细菌细胞的原核细胞。在某些实施方案中，它们是大肠杆菌细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从细菌细胞制备至少一种感兴趣的生物活性分子的高纯度样品的大规模工艺，其包括以下步骤：ａ）通过使所述大量细胞的细胞悬浮液与溶胞溶液接触而制备溶胞产物溶液；ｂ）用中和溶液中和所述溶胞产物溶液以制备包含被中和的溶胞产物溶液和碎片的分散体；ｃ）通过至少一个过滤器过滤所述分散体；ｄ）对所述被中和的溶胞产物溶液进行离子交换分离以产生离子交换洗出液；和ｅ）对所述离子交换洗出液进行疏水作用分离以产生疏水作用溶液。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2007-5-23 60/939,792一种从细菌细胞制备至少一种感兴趣的生物活性分子的高纯度样品的大规模工艺，其包括以下步骤a)通过使所述大量细胞的细胞悬浮液与溶胞溶液接触而制备溶胞产物溶液；b)用中和溶液中和所述溶胞产物溶液以制备包含被中和的溶胞产物溶液和碎片的分散体；c)通过至少一个过滤器过滤所述分散体；d)对所述被中和的溶胞产物溶液进行离子交换分离以产生离子交换洗出液；和e)对所述离子交换洗出液进行疏水作用分离以产生疏水作用溶液。2. 根据权利要求l所述的方法，其中步骤a)包括在高剪切的串联混合器中使所述细胞悬浮液与溶胞溶液混合。3. 根据权利要求l或2所述的方法，其中步骤b)包括在泡罩混合器中将所述溶胞产物溶液与所述中和溶液混合。4. 根据权利要求l-3中任一项所述的方法，其中步骤e)包括使用疏水作用柱或疏水作用膜进行疏水作用分离以形成疏水作用溶液。5. 根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其还包括以下步骤；f) 通过所述疏水作用溶液的超滤来制备生物活性分子的溶液。6. 根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其还包括以下步骤g) 通过所述生物活性分子的溶液的无菌过滤来制备至少一种生物活性分子的无菌溶液。7. 根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其还包括将所述分散体保持一段时间以使所述被中和的溶胞产物溶液与所述碎片分离并且通过至少一个过滤器过滤所述被中和的溶胞产物溶液。8. 根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中制备步骤包括在混合器中使所述细胞悬浮液与所述溶胞溶液接触约1分钟至约20分钟的持续时间。9. 根据权利要求8所述的方法，其中所述持续时间为从约4分钟至约8分钟。10. 根据权利要求8所述的方法，其中所述持续时间为约5分钟。11. 根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述生物活性分子是质粒。12. 根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述离子交换是阴离子交换膜。13. 根据权利要求1_8、11或12中任一项所述的方法，其中步骤e)包括进行疏水作用分离，包括丁基疏水作用色谱，以制备疏水作用溶液，即丁基疏水作用色谱溶液流出液。14. 根据权利要求l-8、或11-13中任一项所述的方法，其中所述方法包括从一个步骤基本上连续地过渡到随后的步骤，并且包括通过将所述溶胞产物收集在容器中并将所述分散体通过初级过滤器而使所述分散体中的所述被中和的溶胞产物溶液与所述碎片分离以制备最初的粗的被中和的溶胞产物溶液。15. 根据权利要求14所述的方法，其还包括使所述最初的粗的被中和的溶胞产物溶液通过二级过滤器以产生随后的粗的被中和的溶胞产物溶液。16. ...

【专利技术属性】
技术研发人员：R德拉吉亚阿克利，H赫贝尔，蔡颖，
申请(专利权)人：VGX药品公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]