嵌合痘病毒制造技术

本发明专利技术涉及具有提高的抗癌活性(更高的癌细胞杀伤能力和更好的肿瘤选择性)的嵌合痘病毒及其具有一个或多个改变的病毒基因的变体版本、其包含一个或多个目标核酸的重组版本及其重组变体版本，所有这些可以包含在组合物中并用于治疗疾病，特别是增殖性疾病，尤其是癌症。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】

本专利技术属于溶瘤病毒领域，提供了特别适用于治疗增殖性疾病(例如，但不限于癌症)的新型嵌合痘病毒。更确切地说，本专利技术提供了通过汇集不同亲代痘病毒株并通过细胞传代选择更有效的嵌合病毒而获得的嵌合痘病毒。与其亲代痘苗病毒copenhagen株(cop)(本领域已知其为特别有效的溶瘤病毒载体)相比，更具体地与其亲代痘病毒相比，这些嵌合痘病毒展现出许多改进的特性。本专利技术的嵌合痘病毒可以通过改变胸苷激酶编码基因(基因座j2r)和/或核糖核苷酸还原酶编码基因(基因座i4l和/或f4l)进行修饰，形成变体嵌合痘病毒。本专利技术的嵌合痘病毒可以进一步编码一种或多种异源转基因，形成重组嵌合痘病毒。与其亲代痘病毒相比，所述重组嵌合痘病毒还表达更高比例的转基因。本专利技术还涉及获得嵌合痘病毒的方法。本专利技术的嵌合痘病毒可以用于治疗增殖性疾病，例如癌症。

技术介绍

1、溶瘤病毒是一类具有肿瘤依赖性自我延续的独特性质的治疗剂(hermiston等人，2006，curr.opin.mol.ther.,8(4):322-30)。使用这些病毒的优势在于随着其复制，它们会裂解其宿本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种嵌合痘病毒，其包含与SEQ ID NO:1具有至少96.6％、优选至少96.7％、至少96.8％、至少96.9％、至少97％、至少97.1％、至少97.2％、至少97.3％、至少97.4％、至少97.5％、至少97.6％、至少97.7％、至少97.8％、至少97.9％、至少98％、至少98.1％、至少98.2％、至少98.3％、至少98.4％、至少98.5％、至少98.6％、至少98.7％、至少98.8％、至少98.9％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％、至少...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

1.一种嵌合痘病毒，其包含与seq id no:1具有至少96.6％、优选至少96.7％、至少96.8％、至少96.9％、至少97％、至少97.1％、至少97.2％、至少97.3％、至少97.4％、至少97.5％、至少97.6％、至少97.7％、至少97.8％、至少97.9％、至少98％、至少98.1％、至少98.2％、至少98.3％、至少98.4％、至少98.5％、至少98.6％、至少98.7％、至少98.8％、至少98.9％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％、至少99.91％、至少99.92％、至少99.93％、至少99.94％、至少99.95％、至少99.96％、至少99.97％、至少99.98％、至少99.99％或甚至100％的同一性的核酸序列。

2.根据权利要求1所述的嵌合痘病毒，其中所述嵌合痘病毒包含来自兔痘病毒utrecht株(rpx)、牛痘病毒brighton株(cpx)、痘苗病毒copenhagen株(cop)、痘苗病毒wyeth株(wy)、痘苗病毒western reserve株(wr)和修饰的痘苗病毒ankara株的核酸片段。

3.根据权利要求1或2所述的嵌合痘病毒，其中所述嵌合痘病毒包含在a34r基因中第151位的谷氨酸。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的嵌合痘病毒，其中所述嵌合痘病毒包含：

5.根据权利要求1至4中任一项所述的嵌合痘病毒，其中对于至少一种肿瘤，所述嵌合痘病毒的溶瘤能力高于在相同条件下以及相同的感染后时间测量的五种野生型亲代溶瘤痘病毒株rpx、cpx、cop、wy和wr中的至少一种的溶瘤能力，优选高于野生型亲代cop或亲代rpx，优选高于五种野生型亲代溶瘤痘病毒株rpx、cpx、cop、wy和wr中的至少两种，更优选高于野生型亲代cop和亲代rpx，更优选高于五种野生型亲代溶瘤痘病毒株rpx、cpx、cop、wy和wr中的至少三种，更优选高于至少四种，甚至更优选高于每一种，其中，对于给定的肿瘤、给定的病毒、给定的条件和给定的感染后时间，溶瘤能力op(肿瘤、病毒、条件、感染后时间)定义为：

6.根据权利要求5所述的嵌合痘病毒，其中所述肿瘤选自a549、mia paca-2、u-87-mg、b16f10和hepg2肿瘤细胞系。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的嵌合痘病毒，其中对于至少一种健康细胞(优选原代细胞)，所述嵌合痘病毒在健康细胞(优选原代细胞)中的病毒复制低于五种溶瘤亲代痘病毒株(任选变体和/或重组的)兔痘病毒utrecht株(rpx)、牛痘病毒brighton株(cpx)、痘苗病毒copenhagen株(cop)、痘苗病毒wyeth株(wy)和痘苗病毒western reserve株(wr)中的至少一种的病毒复制，优选低于野生型亲代cop的病毒复制，优选低于五种野生型亲代溶瘤痘病毒株rpx、cpx、cop、wy和wr中的至少两种、更优选至少三种、更优选至少四种、甚至更优选每一种的病毒复制。

8.根据权利要求7所述的嵌合痘病毒，其中所述健康细胞(优选原代细胞)选自皮肤细胞和肝细胞。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的嵌合痘病毒，其中对于至少一种器官，所述嵌合痘病毒的治疗指数高于在相同条件下以及相同的感染后时间测量的五种溶瘤亲代痘病毒株兔痘病毒utrecht株(rpx)、牛痘病毒brighton株(cpx)、痘苗病毒copenhagen株(cop)、痘苗病毒wyeth株(wy)和痘苗病毒western reserve株(wr)中的至少一种的治疗指数，优选高于野生型亲代cop的治疗指数，优选高于五种溶瘤野生型亲代痘病毒株rpx、cpx、cop、wy和wr中的至少两种，更优选高于至少三种，更优选高于至少四种，甚至更优选高于每一种；其中，对于给定的器官、给定的肿瘤、给定的病毒、给定的条件和给定的感染后时间，器官特异性治疗指数ti(器官、肿瘤、病毒、条件、感染后时间)定义为：

10.根据权利要求9所述的嵌合痘病毒，其中所述器官是肝脏，器官健康细胞是健康的(优选原代)肝细胞以及器官肿瘤细胞是hepg2肿瘤细胞。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的嵌合痘病毒，其中对于至少一种生产者细胞(优选肿瘤细胞)，所述嵌合痘病毒的胞外包膜病毒(eev)-分泌能力(sc)(eev-sc)高于在相同条件下以及相同的感染后时间测量的六种亲代痘病毒株兔痘病毒utrecht株(rpx)、牛痘病毒brighton株(cpx)、痘苗病毒copenhagen株(cop)、痘苗病毒wyeth株(wy)、痘苗病毒western reserve株(wr)和修饰的痘苗病毒ankara株(mva)中的至少一种的eev-sc，优选高于亲代野生型cop或亲代野生型rpx的eev-sc，更优选高于六种野生型亲代痘病毒株rpx、cpx、cop、wy、wr和mva中的至少两种的eev-sc，更优选高于亲代野生型cop和亲代野生型rpx的eev-sc，更优选高于六种野生型亲代痘病毒株rpx、cpx、cop、wy、wr和mva中的至少三种、更优选至少四种、以及甚至更优选至少五种或每一种的eev-sc，其中对于给定病毒、给定的生产者细胞、给定的条件和给定的感染后时间，eev-sc(病毒、生产者细胞、条件、感染后时间)定义为：

12.根据权利要求11所述的嵌合痘病毒，其中所述生产者细胞是a549肿瘤细胞系。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的嵌合痘病毒，其中对于至少一种生产者细胞(优选肿瘤细胞)，所述嵌合痘病毒的胞外包膜病毒(eev)-分泌能力(sc)(eev-sc)高于在相同条件下以及相同的感染后时间测量的野生型痘苗病毒ihd-j株的eev-sc。

14.根据权利要求13所述的嵌合痘病毒，其中所述生产者细胞是a549肿瘤细胞系。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的嵌合痘病毒，其中对于至少一种肿瘤，所述嵌合痘病毒的传播能力高于在相同条件下以及相同的感染后时间测量的六种亲代痘病毒株兔痘病毒utrecht株(rpx)、牛痘病毒brighton株(cpx)、痘苗病毒copenhagen株(cop)、痘苗病毒wyeth株(wy)、痘苗病毒western reserve株(wr)和修饰的痘苗病毒ankara株(mva)中的至少一种的传播能力，优选高于亲代野生型cop或亲代rpx的传播能力，更优选高于六种亲代痘病毒株rpx、cpx、cop、wy、wr和mva中的至少两种的传播能力，更优选高于亲代cop和rpx的传播能力，甚至更优选高于在六种野生型亲代痘病毒株rpx、cpx、cop、wy、wr和mva中选择的至少三种、更优选至少四种、更优选至少五种或每一种的传播能力。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的嵌合痘病毒，其中对于至少一种痘病毒特异性抗体和肿瘤，所述嵌合痘病毒的中和率低于在相同条件下以及相同的感染后时间下测量的六种亲代痘病毒株(任选变体和/或重组的)兔痘病毒utrecht株(rpx)、牛痘病毒brighton株(cpx)、痘苗病毒copenhagen株(cop)、痘苗病毒wyeth株(wy)、痘苗病毒western reserve株(wr)和修饰的痘苗病毒ankara株(mva)中的至少一种的中和率，优选低于亲代野生型cop的中和率，优选低于在六种野生型亲代痘病毒株rpx、cpx、cop、wy、wr和mva中选择的至少两种，更优选至少三种，更优选至少四种，更优选至少五种或每一种的中和率，其中，对于给定的病毒、给定的肿瘤、给定的痘病毒特异性抗体、给定的条件和给定的感染后时间，中和率(nt(病毒、肿瘤、条件、感染后时间))定义为：

17.根据权利要求1至16中任一项所述的嵌合痘病毒，其通过定向进化的方法已经获得或可以获得，其中所述方法包括：

18.根据权利要求17所述的嵌合痘病毒，其中在第一步骤(i)中使用的所述亲代痘病毒株选自兔痘病毒utrecht株(rpx)、牛痘病毒brighton株(cpx)、痘苗病毒copenhagen株(cop)、痘苗病毒western reserve株(wr)、痘苗病毒wyeth株(wy)、修饰的痘苗病毒ankara株(mva)、浣熊痘病毒herman株(rcn)、orf病毒nz2株(orf)、伪牛痘病毒tjs株(pcp)、牛丘疹性口炎病毒illinois 721株(bps)、粘液瘤病毒lausanne株(myx)、松鼠痘病毒kilham株(sqf)、禽痘病毒fp9株(fpv)、猪痘病毒kasza株(spv)、yaba样病病毒davis株(yld)和cotia病毒sp an 232株(ctv)，以及更优选选自兔痘病毒utrecht株(rpx)、牛痘病毒brighton株(cpx)、痘苗病毒copenhagen株(cop)、痘苗病毒western reserve株(wr)、痘苗病毒wyeth株(wy)和修饰的痘苗病毒ankara株(mva)。

19.根据权利要求17所述的嵌合痘病毒，其中定向进化方法中的所述易感性肿瘤细胞系来自高等哺乳动物来源，优选所述易感性肿瘤细胞系选自a549、cal-33、hepg2、hct116、hela、sk-mel-1、panc-1、hs746t、sk-ov-3和cv-1，优选a549。

20.一种变体嵌合痘病毒，其由通过改变一个或多个痘病毒基因而被修饰的权利要求1至19中任一项的嵌合痘病毒组成。

21.根据权利要求20所述的变体嵌合痘病毒，其中所述变体嵌合痘病毒在j2r基因座有缺陷。

22.根据权利要求21所述的变体嵌合痘病毒，其中所述变体嵌合痘病毒包含与seq idno:8具有至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％、至少99.91％、至少99.92％、至少99.93％、至少99.94％、至少99.95％、至少99.96％、至少99.97％、至少99.98％、至少99.99％的序列同一性、或甚至100％的同一性的核酸序列。

23.根据权利要求21或22所述的变体嵌合痘病毒，其中对于至少一种肿瘤，所述变体嵌合痘病毒的溶瘤能力高于在相同条件下以及相同的感染后时间测量的在j2r基因座有缺陷的五种变体亲代溶瘤痘病毒株rpx、cpx、cop、wy和wr中的至少一种的溶瘤能力，优选高于在j2r基因座有缺陷的变体亲代cop或变体亲代rpx的溶瘤能力，优选高于在j2r基因座有缺陷的五种变体亲代溶瘤痘病毒株rpx、cpx、cop、wy和wr中的至少两种的溶瘤能力，更优选高于在j2r基因座有缺陷的变体亲代cop和亲代rpx的溶瘤能力，更优选高于在j2r基因座有缺陷的五种变体亲代溶瘤痘病毒株rpx、cpx、cop、wy和wr中的至少三种，更优选至少四种，以及甚至更优选每一种的溶瘤能力，其中，对于给定的肿瘤、给定的病毒、给定的条件和给定的感染后时间，溶瘤能力op(肿瘤、病毒、条...

【专利技术属性】
技术研发人员：P·厄尔布斯，A·芬德利，
申请(专利权)人：特兰斯吉恩公司，
类型：发明
国别省市：