一种大肠表达重组A型肉毒素的制备方法及其应用技术

本发明专利技术提供一种大肠表达重组A型肉毒素(BONT/A)的制备方法及其应用等。具体提供一种重组BONT/A核酸表达盒，包含标签、酶切位点以及BONT/A核酸序列，且BONT/A轻链和重链间未引入外源蛋白酶识别位点。本发明专利技术还提供包含所述核酸表达盒的重组载体、重组菌、编码表达的蛋白等，制备获得的重组BONT/A不引入外源氨基酸或仅在一处引入两个氨基酸，最大程度保证了与天然A型肉毒素一致。本发明专利技术通过新颖的分子设计和制备工艺，高效获得毒性更强且免疫原性低的重组reBONT/A，有利于产业上的广泛应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物工程和医药工程领域，具体涉及表达重组a型肉毒素的表达载体、工程菌、制备重组a型肉毒素的方法及其应用等。

技术介绍

1、天然肉毒杆菌神经毒素(botulinum neurotoxin，bont)是一种由厌氧肉毒梭状芽孢杆菌产生的世界上一致毒性最强的物质之一。目前已经发现了七种血清型的bont，分别为a、b、c、d、e、f和g七个类型，其中a型肉毒素(botulinum neurotoxin of type a，bont/a)在医疗美容和临床治疗中最为常用。

2、目前bont/a主要来源于天然提取，虽然其工艺成熟且具有多年应用历史，但其存在制备工艺复杂、含大量非bont/a组分，以及生产过程存在生物安全风险的限制。相比之下，通过重组技术获得的重组a型肉毒素具有以下明显优势：1)安全性：重组bont/a通过培养重组工程菌发酵培养获得，激活之前毒性较低，消除了从肉毒杆菌中提取bont/a带来的潜在生物安全风险。2)免疫原性低：重组bont/a纯度更高，降低了产生抗药抗体的风险。3)疗效稳定：重组bont/a通过基因重组技术直接表达单一本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种重组A型肉毒素(BONT/A)核酸表达盒，其特征在于，从5’端到3’端依次包含如下元件：编码标签蛋白的核酸，编码酶切位点的核酸，BONT/A核酸序列；其中，所述BONT/A的轻链和重链间未引入外源蛋白酶识别位点。

2.根据权利要求1所述的核酸表达盒，其特征在于，所述标签蛋白包含HIS标签、GSTs标签、MBP标签、NusA标签、SUMO标签、TrxA标签中的一种或多种；所述酶切位点包含HRV 3C酶切位点、肠激酶酶切位点中的一种或多种。

3.根据权利要求1或2所述的核酸表达盒，其特征在于，所述核酸表达盒包含以下(1)或(2)：

<p>4.根据权利要求...

【技术特征摘要】

1.一种重组a型肉毒素(bont/a)核酸表达盒，其特征在于，从5’端到3’端依次包含如下元件：编码标签蛋白的核酸，编码酶切位点的核酸，bont/a核酸序列；其中，所述bont/a的轻链和重链间未引入外源蛋白酶识别位点。

2.根据权利要求1所述的核酸表达盒，其特征在于，所述标签蛋白包含his标签、gsts标签、mbp标签、nusa标签、sumo标签、trxa标签中的一种或多种；所述酶切位点包含hrv 3c酶切位点、肠激酶酶切位点中的一种或多种。

3.根据权利要求1或2所述的核酸表达盒，其特征在于，所述核酸表达盒包含以下(1)或(2)：

4.根据权利要求1-3任一项所述的核酸表达盒，其特征在于，所述his标签的氨基酸序列可以为mgss(h)n，其中n为6-10的整数，优选地，所述his标签的核苷酸序列如seq idno.1所示，his标签的氨基酸序列如seq id no.2所示；所述gsts标签的核苷酸序列如seqid no.3所示，所述gsts标签的氨基酸序列如seq id no.4所示；所述hrv 3c酶切位点的核苷酸序列如seq id no.5所示，所述hrv 3c酶切位点的氨基酸序列如seq id no.6所示；所述linker的氨基酸序列可以为(ggggsgggs)n，其中n为≥1的整数，优选地，n＝1，所述linker的核苷酸序列如seq id no.7所示，所述linker的氨基酸序列如seq id no.8所示；所述肠激酶酶切位点的核苷酸序列如seq id no.9所示，所述肠激酶酶切位点的氨基酸序列如seq id no.10所示；所述bont/a的核苷酸序列如seq id no.11所示，所述bont/a的氨基酸序列如seq id no.12所示。

5.根据权利要求4所述的核酸表达盒，其特征在于，所述rebont/a的核苷酸序列如seqid no.13所示，所述rebont/a的氨基酸序列如seq id no.14所示；所述rebont/a-1的核苷酸序列如seq id no.15所示，所述rebont/a-1的氨基酸序列如seq id no.16所示。

6.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求1-5任一项所述重组a型肉毒素(bont/a)核酸表达盒；优选地，所述重组载体为pet系列载体；更优选地，所述pet系列载体为pet-28a。

7.一种重组表达菌，其特征在于，包含权利要求1-5任一项所述重组a型肉毒素(bont/a)核酸表达盒，或权利要求6所述重组载体；优选地，所述重组表达菌为大肠杆菌；更优选地，所述大肠杆菌包含e.coli bl21(de3)、e.coli origami b(de3)、e.coli rosetta blue(de3)、e.coli c41(de3)；最优选地，所述大肠杆菌为e.coli c41(de3)菌株。

8.一种重组a型肉毒素(bont/a)蛋白，其特征在于，由权利要求1-5任一项所述重组a型肉毒素(bont/a)核酸表达盒编码表达获得。

【专利技术属性】
技术研发人员：吕广新，左涛，刘立，王满朝，
申请(专利权)人：耀海生物技术北京有限公司，
类型：发明
国别省市：