一种基于RPA-CRISPR/Cas12a的支原体检测方法及其用途技术

一种基于RPA‑CRISPR/Cas12a的支原体检测方法，属于生物技术领域，可用于生物制药领域细胞库环境检测、原料质检、细胞培养工艺过程监测、蛋白纯化工艺过程监测。该方法包括制备CRISPR预混液，保存0‑7天，RPA预扩增，CRISPR反应等步骤。该方法具有操作便捷、结果稳定、精密可靠、易于推广的特点，能够半定量快速分析支原体浓度，可在CHO细胞培养24小时内捕获微量支原体信号，较传统培养法缩短95%检测周期，下游纯化工艺中即便经0.02~0.2 μm深度过滤仍可检出低拷贝的核酸残留，可显著降低污染的安全性风险。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物。更具体地，本申请涉及一种基于rpa-crispr/cas12a的支原体检测方法及其用途。

技术介绍

1、支原体（mycoplasma）是一种独特的微生物，它们缺乏细胞壁，因而对细胞培养中常用的抗生素表现出天然的耐药性。这些微生物体积微小，形态多变，能够轻松通过0.22微米（μm）的过滤器，因此，传统的显微镜检查很难将它们检测出来。支原体能够通过多种机制对细胞培养的性能和产品质量产生影响，还能改变宿主细胞的基因表达谱，从而影响细胞的正常功能和生产过程。因此在细胞培养和生物制药领域中被视为潜在的污染物，需要通过精确的检测和控制措施来管理。

2、在药典规定的支原体检测方法中，培养法被视为金标准。该方法通过将细胞培养样品接种到液体和固体培养基中进行培养，以检测支原体的存在。这种检测方法具有很高的灵敏度，但存在检测周期较长、广谱性不佳的问题。另外，细胞染色法通过培养细胞后加入荧光dna结合染料，并在荧光显微镜下观察是否存在支原体污染，相较于传统培养法，该方法在检测速度上具有优势，但灵敏度较低且需要和专业知识来进行准确判断结果。因此，亟本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种基于RPA-CRISPR/Cas12a的支原体检测方法，其特征是，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的基于RPA-CRISPR/Cas12a的支原体检测方法，其特征是，所述的CRISPR预混液每18 μL由以下成分混合而成：

3.根据权利要求1所述的基于RPA-CRISPR/Cas12a的支原体检测方法，其特征是，所述的第二步的方法是，将待测样品、280 mmol/L MgOAc、RPA预混液以4:1:20的体积比混匀后，37℃孵育20分钟，得到RPA预扩增产物，所述的RPA预混液由以下成分混合而成：

4.根据权利要求1所述的基于RPA-C...

【技术特征摘要】

1.一种基于rpa-crispr/cas12a的支原体检测方法，其特征是，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的基于rpa-crispr/cas12a的支原体检测方法，其特征是，所述的crispr预混液每18 μl由以下成分混合而成：

3.根据权利要求1所述的基于rpa-crispr/cas12a的支原体检测方法，其特征是，所述的第二步的方法是，将待测样品、280 mmol/l mgoac、rpa预混液以4:1:20的体积比混匀后，37℃孵育20分钟，得到rpa预扩增产物，所述的rpa预混液由以下成分混合而成：

4.根据权利要求1所述的基于rpa-crispr/cas12a的支原体检测方法，其特征是，所述的第三步的方法是，将第一步制备的crispr预混液与第二步获得的rpa预扩增产物以9:1的体积比混合均匀，37 ℃下孵育20...

【专利技术属性】
技术研发人员：张大鹏，郭怀祖，徐进，高天宇，钱卫珠，侯盛，郭清城，王晨光，张浔敏，王皓，
申请(专利权)人：温州医科大学，
类型：发明
国别省市：