公开了已经通过ｃＤＮＡ克隆和聚合酶链反应技术制备的重组犬ＴＲＰＶ２通道。也公开了这些通道的表达体系及使用该表达体系的测定。重组ＴＲＰＶ２通道可用于评价化合物的测定中，所述化合物与ＴＲＰＶ２通道直接或间接相互作用或结合。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及犬TRPV2(cTRPV2)通道、该通道的克隆、筛选TRPV2 通道调节剂的方法及其用途。
技术介绍
热和冷都引发温度感觉(thermosensation )，如果温度感觉有足够 的强度，则可以引起疼痛的感觉。在哺乳动物中的温度检测是维持温度 体内稳态并保护免于潜在的伤害性温度极端中的重要功能。大量努力被 投入到阐述牵涉于神经元组织中热和冷感觉的检测、转换和传递相关的 生物化学机制上。温度刺激活化位于例如衍生自背根神经节(DRG)和 三叉神经节(TG)的感觉神经元上的特化受体。当这些刺激在有害范围 内(即非常热或冷)时，它们激活感觉神经元亚群上的被称为伤害感受 器的热敏感受体的特定子集(痛感受神经元)。活化后，热敏感受体(例 如离子通道)将有害刺激转换为电信号，所述电信号沿感觉神经元向脊 髓传播，在脊髓转播到脑，最终导致疼痛的知觉。因此，这些热敏感受 体代表了很有前途的药物开发靶，所述药物用于治疗多种疼痛状况、特 别是存在温度超敏反应和/或温度引发的疼痛的状况。几个热敏感受体已经牵连到感觉温度变化中。当前，六个瞬时受体 电位(TRP)离子通道家族成员被提议起到在有害热到有害冷范围内的 温度的温度传感器的作用，并因此被称为温度-TRP。非选择性阳离子通 道温度-TRP也对例如辣椒素、薄荷醇芥子油等化学刺激敏感，已知所 述辣椒素、薄荷醇芥子油等产生烧灼或冷却感觉。重要的是，所有温度 -TRP都在伤害性感觉神经元A5-或C-纤维中表达，其中发生温度、机械 和化学感觉转换。TRPV1是该家族中表征最为充分的成员，由中度热 ( 43°C)、辣椒素、质子和某些脂类介质例如花生四烯酸乙醇酰胺活化(Catenna, M. J.等人，1997, A^w 389(6653), 816-824; Tominaga等人， 1998, A^ww7 21(3), 531-543)。此外，使用多种实验方法的多个研究提示 TRPV1处于痛觉过敏动物模型的疼痛信号转换中(Caterina, M. J.等人， 2000, Sc,ece 288(5464), 306-313; Davis, J. B.等人，2000 A^we 405(6783), 183-187);因此，将TRP激进地追踪为緩解某些类型疼痛的 靶。瞬时受体电位V2 (TRPV2)蛋白质(早先被称为并已知为香草素受 体样1或VRL-1)是瞬时受体电位(TRP)超家族成员，其已牵涉于介导 不同细胞功能，包括温度、化学和机械刺激的转换。TRPV2与TRPV1 密切相关，并且通过从大鼠和人(Caterina等人，1999, Atow 398(6726), 436-441)及小鼠(Kanzaki等人,1999,淑Ce諸o/ 1(3), 165-170)的同 源克隆得到鉴定。功能性研究已揭示，大鼠TRPV2以52。C以上的激活 阈对有害热应答(Caterina, Rosen等人，1999),而小鼠TRPV2对渗透 性改变或膜牵张应答(Muraki等人,2003, Oc 93(9), 829-838)。 TRPV2表达于背根神经节(DRG)中的中等到大直径AS机械和温度感 觉神经元的发现，进一 步支持其是有害热和机械牵张的内源性传感器的 假说(Catenna等人，1999, Atowre 398(6726), 436-441)。然而，与TRPV1不同，没有TRPV2的选择性激活剂得到报告。最 近， 一类活化人、大鼠和小鼠TRPV2的新的选择性激动剂已得到鉴定， 所述选择性激动剂例如A、四氢大麻酚(A9-THC)和其他相关大麻素。 (见美国申请系列号11/589,340, 0爭人，名称为:^定77WF2源，浙的 遂合參和才法rC(W尸OS777CWS爿M)感777(9DS TO尺舰甜F藩G M(9Z)L^4r(9尺S OF 7T^F2 J ,于2006年10月30日提交)。需要鉴定额外的热敏感受体，因为它们是疼痛治疗的潜在耙。也需 要鉴定不同物种中的热敏感受体，因为它们可以用作模式体系以研究测 试化合物的作用。具体而言，需要可用于测试化合物的体系，所述化合 物可能增加或降低热敏感受体应答有害温度刺激(包括有害热刺激)的 活性。这类化合物的鉴定和测试将使得能够治疗与神经病疼痛、炎症疼 痛、多种慢性疼痛相关的多种失调，或用于其它状况，例如炎症免疫应 答、热性癲痫发作和全身性癫痫和/或存在温度超敏反应或温度引发的疼 痛的状况，以及与这些热敏感受体相关的其它人类疾病。专利技术概述本专利技术涉及犬TRPV2的重组DNA和蛋白质。该蛋白质可用于高通量测定，对于鉴定功能性TRPV2的调节剂有用。本专利技术也涉及在此公开的测定中鉴定的调节剂及其作为治疗剂的用途。在下面包括专利技术详述及其优选实施方案和附加权利要求的公开内容中，本专利技术的其它方面、特点和优势将显而易见。附图简述附图说明图1说明犬TRPV2 cDNA (SEQ ID NO: 1)的核苷酸序列和蛋白质翻译。图2说明犬TRPV2 (SEQ ID NO: 2)的氨基酸序列。图3说明犬TRPV2核苷酸序列与人TRPV2核苷酸序列(Genbank登记号AF129112)(SEQIDNO: 3)的比对。序列享有87.0 %的相似性和84.2%的同一性。图4说明犬TRPV2氨基酸序列和人TRPV2氨基酸序列(Genbank登记号AF129112)(SEQIDNO: 4)的比对。序列享有85.9 %的相似性和85.9%的同一性。图5说明人、鼠、大鼠和犬TRPV2肽序列之间的百分比同源性。图6说明在用犬TRPV2表达(黑线)或pcDNA3.1载体对照(灰线)质粒DNA瞬时转染的HEK293细胞中，细胞钩水平随添加100 △、四氢大麻酚(THC)的变化。RFU:相对荧光单位。专利技术详述在此引用的所有出版物都引用作为参考。除非另有说明，这里使用的所有技术和科学术语都具有与本专利技术所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。如本文中所用的，术语包含、含有、具有和包括以开放性非限制含义使用。多肽或核酸的活性、生物学活性或功能活性指多肽或核酸分子根据标准技术通过体内或体外确定的所发挥出的活性。这类活性可以是直接活性，如对第二个蛋白质的结合或酶促活性或离子酶活性，或.间接活性，例如通过该蛋白质与一个或多个其他蛋白质或其他分子相互作用所介导的分子信号传导活性，所述相互作用包括但不限于以多步骤连7续方式发生的相互作用。在此所用的生物样品，，或样品，，指含有细胞或组织物质或由细胞或组织物质组成的样品，例如细胞、与细胞有关的体液、生物流体、培养物上清液、DNA、 RNA或从受试者或患者分离的蛋白质。受试者可以是细菌，酵母，节肢动物，哺乳动物例如大鼠、小鼠、犬、人，或作为治疗、观察或实验目标的任何其他生物。生物样品的实例包括例如唾液、痰、血液、血细胞(例如白细胞)、羊水、血浆、精液、骨髓、组织或细针活组织4企查样品、尿液、腹水、胸膜液和细力包培养物。生物样品也可以包4舌组织切片，例如出于组织学目的的冷冻切片。细胞指适合于检测方法灵敏度的至少 一个细胞或多个细胞。适于本专利技术的细胞可以是哺乳动物例如犬细胞或其他原核生物细胞。克隆是通过有丝分裂从单个细胞或共同祖先衍生的细胞群。本文档来自技高网...
【技术保护点】
基本纯化的核酸分子，所述核酸分子含有编码能够具有ＴＲＰＶ２活性的多肽的核苷酸序列，并且与ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１具有至少９０％的序列同一性。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2007-3-7 60/893,4451.基本纯化的核酸分子，所述核酸分子含有编码能够具有TRPV2活性的多肽的核苷酸序列，并且与SEQ ID NO1具有至少90％的序列同一性。2. 基本纯化的多肽，所述多肽能够具有TRPV2活性，并且与SEQ ID NO: 2具有至少90%的序列同一性。3. 核酸探针，所述核酸探针具有至少18个核苷酸但少于999个核 苷酸，其在严格杂交条件下与SEQ ID NO: l编码的多核苷酸选择性杂交。4. 核酸探针，所述核酸探针选自SEQ ID NO: 5、 SEQIDNO:6、 SEQ ID NO:7、 SEQ ID NO: 8、 SEQ ID NO: 9、 SEQ ID NO: 10和SEQ ID NO: 11,其在严格杂交条件下与SEQ ID NO: 1编码的多核苷酸选择性杂交。5. 抗体，所述抗体特异性结合能够具有TRPV2活性的多肽，其中 所述多肽与SEQ IDNO:2具有至少90%的序列同一性。6. 权利要求5的抗体，其中所述抗体是多克隆抗体或单克隆抗体。7. 含有权利要求5的抗体的试剂盒。8. 检测样品中TRPV2多核苦酸的方法，包括步骤(a) 将多核普酸与核酸探针接触，所述核酸探针具有至少18个核苷 酸但少于999个核苷酸，在严格杂交条件下与多核苷酸选择性杂交；及(b) 以所述核酸探针检测多核苷酸。9. 检测多肽的方法，所述多肽能够具有TRPV2活性，并且与SEQ IDNO:2具有至少90%的序列同一性，该方法包括步骤(a) 将多肽与特异性结合SEQIDNO:2的抗体接触；并(b) 检测与该抗体结合的多肽。10. 鉴定TRPV2通道调节剂的方法，包括步骤(a) 将TRPV2通道与测试化合物接触，所述TRPV2通道与SEQ ID NO: 2具有至少90%的序列同一性；并(b) 检测TRPV2活性水平。11. 权利要求10的方法，其中的接触步骤另外包括将测试化合物与 表达TRPV2通道的细胞接触的步骤。12. 权利要求ll方法，其中所述细胞编码重组TRPV2通道。13. 权利要求ll方法，其中所述细胞内源性表达TRPV2通道。14. 权利要求10的方法，其中冲企测TRPV2活性水平的步骤包括测 量细胞钙水平中的变化。15. 鉴定可用于治疗疼痛的化合物的方法，包括步骤0)将TRPV2通道与测试化合物接触，所述TRPV2通道与SEQ ID NO:2具有至少90%的序列同一性；并 (b)检测TRPV2活性水平。16. 权利要...
【专利技术属性】
技术研发人员：N秦，CM弗洛里斯，MP尼珀，
申请(专利权)人：詹森药业有限公司，
类型：发明
国别省市：BE[比利时]
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