本发明专利技术涉及使抗体片段二聚化的方法、抗体片段二聚体、含抗体片段二聚体的药用组合物，以及它们在治疗应用的药物中的用途。所述方法可有利地用于生产双特异性抗体和／或其双特异性片段。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及蛋白质化学领域，特别是涉及抗体片段的二聚化。
技术介绍
对两个独立的抗原具有亲合力的双特异性抗体，先前已有描述(由Holliger和Winter 1993 C跳Opin. Biotech. 4, 446-449综述(也见Poljak: R. J.,等(1994) Structure 2: 1121-1123; Cao等(1998), Bioconjugate Chem. 9, 635-644); Aramwit等，未来的药物(Drugs of the Future) 2005， 30， 1013-1016; Moosmayer等Clin. Cancer Res. 2006, 12, 5587-5595)。这样的抗体可特别用于(除了别的以外)针对靶位，例如肺瘤的细胞毒性 剂或免疫效应器细胞的再定向(redirection)。迄今为止，已经通过采用 连接基连接两个独立抗体的VH和VL域建立了大多数双特异性抗体， 所述连接基太短以至于不能使各域之间在同一链上配对，因而驱使互 补的域之间在不同的链上配对，以再建立两个抗原-结合位点。这种类 型的抗体分子缺乏Fc域，并且因此缺乏抗体引发效应器功能的能力 (如补体激活，Fc-受体结合等)，并且由于其相对小的尺寸，半衰期通-结合部分，并且两个部分均可经重组表达。例如，Albrecht等 (Bioconjugate Chem. 2004， 15, 16-26.)描述了 二聚化的ScFvs,其经二硫 代-连键而二聚化的。已经用作两个生物分子的共价轭合的间隔基的双功能分子，已由 Li等描述(Bioorg. Med. Chem. Lett, 2005， 15， 5558-5561)。然而，为了 双特异性抗体构成物的制备，使用无论哪一种方法，两个不同抗原-结合部分的连接是制备中的关键问题。随机二聚化将导致难以分离的许多不同偶联产物的混合物。用于控制相互反应的片段的连接的现有的方法，为例如孔中的杵状结构(knob-in-hole)突变(Carter， J. Immunol. Methods 2001, 248, 7-15.)、亮氨酸4立链(leucine-zippers) (Kostelny,等J. Immunol. 1992， 148， 1547-1553.)或寡核苷酸配对(oligonucleotide pairing) (Chaudri等FEBS Letters, 1999， 450, 23-26.)。其中来自两个具不同特异性的抗体的重链和轻链抗体可变域稠合在一起，作为一条单 一多肽链的构成物也已^皮描述(Kipriyanov和Le Gall， Current Opinion in Drug Discovery & Development, 2004， 7， 233-242.)。为制备杂-二聚构 成物，主要的问题是控制哪几条单体将要形成二聚体。以作者的学识 认为，没有现成的方法，其中的二聚化过程是仅靠化学反应控制的。因而，对改良的和替代的用于生产二聚化抗体构成物，例如，双 特异性抗体或其片段的方法存在需求，所述构成物是以商业上相应的 得率获得的并且经历纯化。专利技术简述为了克 服以上提及的、用于使抗体片段二聚化的已知方法的局限 性，本专利技术现在提供用于使两个抗体片段在各自重链(HC) C-末端二聚 化的方法，该方法包括修饰C-末端和使C-末端反应，以形成两个抗 体片段间的共价键。本专利技术还提供含两个抗体片段的二聚体的化合 物，其中所述抗体片段在它们的重链(HC)多肽的C-末端偶联。本专利技术 还提供抗体片段，其中依据本专利技术对HC多肽的C-末端进行修饰。依据由本专利技术提供的方法， 一个抗体片段带有一个化学官能团， 其不出现在第二个抗体片段中，而第二个抗体片段带有另一个化学基 团，其不出现在第一个抗体片段中。当这两种化学基团相互反应导致 化学键时，可获得二聚化。在具体的实施方案中，如在附图说明图1中概述的，抗体二聚化的片段是 Fab-片段，各自包含至少与轻链(LC)相关联的HC的可变域。然后， 连接HC多肽的C-末端以形成Fab2片段。本专利技术的方法已经显示对以高得率和纯度产生二聚化的Fab-片段 是有用的，并且用于允许两个组成的Fab-片段以保留完整的N-末端。 类似的原则可应用于其它抗体片段在HC多肽的C-末端的二聚化过程。在一个方面，本专利技术提供使两个抗体片段二聚化的方法，该方法 包括以下步骤(a) 引入第一个化学基团至第一个抗体片段的C-末端，(b) 引入第二个化学基团至第二个抗体片段的C-末端，和(c) 使第一个化学基团与第二个化学基团反应，形成两个抗体片 段的共价键。在另一个方面，本专利技术提供用于使抗体的两个抗体片段 二聚化的方法，其包括以下步骤(a)通过在亲核试剂的存在下与酶反应，引入第一个化学基团至 第一个抗体片段的C-末端，(b')通过在亲核试剂的存在下与酶反应，引入第二个化学基团至 第二个抗体片段的C-末端，和(c)使第一个化学基团与第二个化学基团反应，形成两个抗体片 段的共价键。在另 一个方面，本专利技术提供用于使抗体的两个抗体片段二聚化的 方法，其包括以下步骤(a)通过在亲核试剂的存在下与酶反应，引入第一个化学基团至 第一个抗体片段的C-末端，(b)通过在亲核试剂的存在下与酶反应，引入第三个化学基团至 第二个抗体片段的C-末端，(b')使第三个化学基团与与带有第四个和第二个化学基团的分 子反应，通过第三个化学基团和第四个化学基团的反应，使所述分子 共价连接至第二个抗体片段的C-末端，和(c)使第一个化学基团与第二个化学基团反应，形成两个抗体片 段的共价键。在以上描述的每个方法的一个实施方案中，每个抗体片段是Fab-片段。在以上描述的每个方法的另一个实施方案和实施方案中，所述抗 体片段具有不同的结合特征，结合例如不同的抗原或同 一抗原的不同 抗原决定部位。在以上描述的每个方法的另一个实施方案和实施方案中，至少一 个，任选两个抗体片段的HC多肽的C-末端氨基酸序列是 -Leu-Leu-Ala。在另一个方面，通过丝氨酸-蛋白酶实施酶-催化的修饰。在一个 实施方案中，通过丝氨酸-羧肽酶实施酶-催化的修饰。在另一个实施 方案中，通过酶羧肽酶Y实施酶-催化的》务饰。在另一个方面，本专利技术涉及包含其中的C-末端氨基酸序列是 -Leu-Leu-Ala的HC多肽的抗体片段，以及涉及其在以上描述的方法 中的应用。在一个实施方案中，抗体片段是Fab-片段。图的描述图1概述如应用于使Fab-片段二聚化的依据本专利技术用于使抗体片 段二聚化的方法。图2显示如在实施例1 ，步骤3中描述的、二聚化的Fab-片段制 备物的非还原(A)和还原(B) SDS-凝胶分析。非还原SDS-凝胶显示孔3 和4中的两个浓度的起始Fab-片段。孔5-12显示在不同反应时间二聚 化(步骤3)过程中的反应混合物，每个以两个浓度存在。还原SDS-凝 胶显示，在孔2中的起始Fab-片段，和孔3中的步骤3后的反应产物。专利技术详述本专利技术提供为两个抗体片段的二聚体的化合物，其中所述抗体片 段在它们的重链(HC)多肽的C-末端偶联。在一个实施方案中，所述化合物包含由非-肽键偶联的抗体片段。在另一个实施方案中本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种为两个抗体片段的二聚体的化合物，其中所述抗体片段在它们的重链（ＨＣ）多肽的Ｃ－末端偶联。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】EP 2007-3-5 07103517.41.一种为两个抗体片段的二聚体的化合物，其中所述抗体片段在它们的重链(HC)多肽的C-末端偶联。2. 依据权利要求l的化合物，其中第一个HC多肽的C-末端具 有以下结构H 卄O ，其中第一个多肽用*标记，而第二个HC-多肽连接至基团R絲气3. 依据权利要求2的化合物，其中第一个HC-多肽的C-末端具 有以下结构r速接基-Leu-LeU\ ,NH N HN' v 2 4. 一种抗体片段，其中所述HC-多肽的C-末端具有以下结构rrgN ^< 2 H II O其中的HC多肽用标记，而R^是带有选自叠氮化物、炔烃、O-烷 化的羟胺、酮、醛、1,2-二醇或1，2-氨基醇的基团的基团。5. 权利要求4的抗体片段，其中所述HC-多肽的C-末端具有以 下结构H、Leu-Leu、 ,NH， N 26.权利要求4-5中任一项的抗体片段，其中-Rg选自7. —种用于使两个抗体片段二聚化的方法，该方法包括以下步骤(a)将第一个化学基团引入到第一个抗体片段的HC多肽的C-末(b) 将第二个化学基团引入到第二个抗体片段的HC多肽的C-末 端，和(c) 使第一个化学基团与第二个化学基团反应，形成两个抗体片 段的共价键。8. 依据权利要求7的方法，该方法包括以下步骤(a')通过在亲核试剂的存在下与酶反应，将第一个化学基团引入 到第一个抗体片段的HC多肽的C-末端，(b')通过在亲核试剂的存在下与酶反应，将第二个化学基团引入 到第二个抗体片段的HC多...
【专利技术属性】
技术研发人员：K克加德，B佩施克，
申请(专利权)人：诺沃诺迪斯克有限公司，
类型：发明
国别省市：DK[丹麦]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。